發(fā)布時間：2017-08-06 07:12

  本文關鍵詞：神經(jīng)分子影像技術平臺的建立-PET雙靶點分子探針在AD早期診斷的基礎及臨床研究

  更多相關文章： ~(18)F標記 神經(jīng)纖維纏結 β淀粉樣蛋白 阿爾茨海默病 特異性分子探針 正電子發(fā)射計算機斷層掃描 自動化放射性合成 化學動力學 生物學特性

【摘要】：一、背景阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種不可逆性、進展性神經(jīng)退行性疾病,病理特征是神經(jīng)細胞外β淀粉樣(amyloid-β,Aβ)老年斑(senile plaques, SPs)沉積和神經(jīng)細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFTs)形成和神經(jīng)元及神經(jīng)突觸的丟失,臨床特征是記憶缺失和認知損害,通常在確診后7-10年內(nèi)死亡,AD是老年人癡呆的主要類型。AD不但給患者和家人帶來巨大的痛苦,而且對家庭及衛(wèi)生體系帶來沉重的社會經(jīng)濟壓力,隨著大多數(shù)國家人口老齡化的加劇,這種負擔在不久的將來將會凸顯出來。像使用乙酰膽堿酯酶抑制劑、谷氨酸調(diào)節(jié)劑對癥治療只能暫時穩(wěn)定病情,而沒有明顯的記憶功能改善�，F(xiàn)在還沒有有效的減慢AD神經(jīng)退行性改變的治療藥物,AD是目前世界上主要的健康問題。在沒有理想的生物標志物的前提下,目前AD的診斷方法主要包括臨床行為學測試、磁共振(resonance imaging (MRI)、正電子發(fā)射計算機斷層掃描(positron emission tomography, PET)、腦脊液標志物檢測。臨床上,AD的診斷主要根據(jù)NIH-ADAD標準進行神經(jīng)精神行為學測試,以排除其他類型的癡呆,但是,診斷準確率可以波動于50-90%,AD的確診還是得通過腦尸解時發(fā)現(xiàn)病皮層有一定量的神經(jīng)纖維纏結和神經(jīng)炎性老年斑。因此,結合神經(jīng)科學以可靠、無創(chuàng)診斷AD具有極其重要的價值。有效的腦內(nèi)生物標志物在鑒別和隨訪AD高危人群及評價目前正在研究的新的治療方面非常有用。許多科學家致力于研發(fā)具有高進腦量、病理改變區(qū)高特異性結合的靶向顯像劑。PET是敏感的分子影像手段,能夠體內(nèi)定量分析放射性示蹤劑的皮摩爾級別的濃度,從而實現(xiàn)從分子水平無創(chuàng)定位、在患者無癥狀時監(jiān)測疾病進程,此時,計算機斷層掃描(computerized tomography, CT)、MRI上尚沒有明顯的解剖改變。由于活檢不能直接反映患者腦內(nèi)淀粉樣蛋白隨著時間沉積的進程,PET影像檢查在反映AD的自然進程方面極具價值。而且,PET放射性藥物是基于段半衰期的正電子射線,因此PET可以用來無創(chuàng)性評價及監(jiān)測藥物的動力學變化。PET無創(chuàng)體外定量分析腦內(nèi)Aβ斑塊和NFTs沉積的分子影像探針為AD的早期診斷和病情進展評價提供創(chuàng)新技術。這些顯像劑可以檢測Aβ和磷酸化tau蛋白,同時能監(jiān)測其隨時間的變化,能夠針對腦內(nèi)局部或全腦的SPs和NFTs提供準確、可靠、可重復的定量分析方法,對治療方法的篩選和評價抗Ap和抗磷酸化tau蛋白的治療都非常重要。綜上而言,PET的運用將會極大的促進AD的早期診斷,研發(fā)具有良好特性,能與淀粉樣蛋白和神經(jīng)纖維纏結靶向結合的分子探針非常有必要。作為定量的神經(jīng)影像探針,特異性的放射性示蹤劑通常需要具有一些關鍵的共性,即理應是脂溶性的已能通過血腦屏障,而且不能被代謝掉,同時要具有與靶組織的可逆性的特異性結合。本課題研發(fā)新的有潛能的示蹤劑以能通過PET顯像將淀粉樣蛋白和神經(jīng)纖維纏結可視化能對這些物質(zhì)進行臨床前評價。二、內(nèi)容第一部分[18F]-THK523的核素標記及標記條件優(yōu)化目的：盡管多年來AD病理機制以Ap毒性為中心,但是tau蛋白導致的病理機制今年來得到越來越多的重視。在AD病理進程中,海馬及內(nèi)嗅皮質(zhì)NFTs的沉積,而不是神經(jīng)細胞丟失、腦萎縮和炎性老年斑在癡呆病情進展中與行為學退化的嚴重程度呈相關性,NFTs由高度磷酸化Tau蛋白為主的雙股螺旋纖維絲構成。NFTs是AD的標志性病理改變,并且與癡呆的嚴重程度緊密相關,因此是AD改變病程的治療靶點之一,特異性NFTs PET分子探針在研制AD新的治療藥物中將會發(fā)揮重要作用。本課題進一步改進制備NFTs探針[18F]-THK523,建立自動化工藝。方法：改進合成高純度[18F]-THK523保護型前體THK-7和標準品THKF-2,并進行結構鑒定和質(zhì)量控制,建立遠程控制的自動化[18F]-THK523制備工藝,對[18F]-THK523親核反應動力學進行分析,優(yōu)化[18F]-THK523標記條件,完成[18F]-THK523物理、化學、生物學等質(zhì)量控制。結果：前體THK-7、標準品THKF-2質(zhì)量控制顯示其結構鑒定吻合,純度均大于99%,細菌性和內(nèi)毒素檢測均為陰性。[18F]-THK523質(zhì)量控制顯示,[18F]-THK523的保留時間在6.12 min,標準品THKF-2的保留時間在5.93 min,前體THK-7的保留時間在12.94 min,[18F]-THK523與THK-7兩者分離度較好,峰面積積分獲得放化純大于90%。[18F]-THK523澄清、透明、無沉淀,pH值為6.6-7.0,放射性濃度為12.3 mCi/mL,放射性半衰期為109±2 min,乙醇含量10%,無菌濾膜通透性壓力≥0.4 MPa,細菌學和內(nèi)毒素實驗為陰性。[18F]-THK523達到較高的放射性合成產(chǎn)率(70±5%,n=6,衰減矯正到靶轟擊結束),具有高放化純(90%)和比活度(2.5±0.5Ci/μmol),整個制備過程約45-55 min。平均標記率和比活度隨反應時間和溫度的增加而增加。反應速率常數(shù)k隨著溫度的升高而增加,而與前體的濃度無關。反應動力學研究顯示,保護型前體THK-7可以通過親核反應很容易生成[18F]-THK523。第二部分[18F]-THK523的生物學特性研究目的：任何一種理想的放射性藥物的代謝和分布模式對于臨床前研究到臨床研究都具有重要意義。本課題通過分析[18F]-THK523的生物學特性,以評價[18F]-THK523是否能做完一種理想的腦顯像劑。方法：室溫下放置4h測定[18F]-THK523的體外穩(wěn)定性；磷酸鹽(pH=7.4)／水體系中測定[18F]-THK523脂水分配系數(shù)；磷酸鹽／乙醇體系中電泳測定[18F]-THK523帶典性；四個[18F]-THK523劑量、濃度組的血漿蛋白結合率測定；[18F]-THK523在正常C57小鼠體內(nèi)的分布；[18F]-THK523在正常C57小鼠的Micro PET顯像；不同劑量[18F]-THK523急性毒性研究；放射自顯影是研究放射性配體的最常用方法,可以直接比較體外PET示蹤劑的放射自顯影圖像與體內(nèi)PET圖像；值得一提的是,每個顯像劑的動力學需要與PET相匹配,比如說,現(xiàn)象劑與靶點的結合需要在PET檢查的時間窗內(nèi)達到平衡。一個理想的PET顯像劑必須通過臨床前研究證明具備這些重要的標準。結果：應用抗壞血酸防止輻射自分解后,穩(wěn)定性測定顯示,在室溫下放置4h后,Rf仍然大于90%,適合做下一步體內(nèi)外實驗。通過實驗測得[18F]-THK523的脂水分配系數(shù)lgP為0.99土0.06、電性為不帶電荷及血漿蛋白結合率較低且不具有質(zhì)量濃度依賴性,同時[18F]-THK523為小分子(分子量僅為281)。綜上而言[18F]-THK523滿足腦顯像劑的基本要求。藥代動力學實驗顯示[18F]-THK523迅速從血液分布到其他組織器官(t1/2α= 47.92 min),并且在組織中有適中的保留時間(t1/2β= 965.10 min),符合房室模型,其方程式為Y= 2.23e-0.014t+1.89-00007t K12為0.0067 min-1,K21為0.0070 min-1, Ke為0.0015 min-1,血漿清除率(Plasma Clearance, CL)為0.0359 ID%g-1 min-1,藥物濃度-時間曲線下面積(area under concentration-time curve, AUC)為2785.08 ID%g-1min。體內(nèi)分布研究顯示,正常小鼠生物分布實驗顯示[18F]-THK523給藥后2 min具有較高進腦量,特別是海馬區(qū)域,隨后快速清除。[18F]-THK523急性毒性研究呈陰性�？偠灾�,[18F]-THK523小分子量,穩(wěn)定性好,電中性、脂溶性的,并且不具備血漿蛋白濃度依賴性。前期研究顯示,[18F]-THK523具有腦顯像劑的優(yōu)勢,有望進一步研究。第三部分[11C]-PIB全自動合成及相關顯像研究目的：為改善[11C]-PIB的自動化制備,提高其放化純和比活度,減輕臨床注射疼痛。應用PMOD軟件對[11C]-PIB PET/MRI進行分析,探討[11C]-PIB PET定量分析方法,為今后Tau蛋白顯像的臨床應用提供參考。方法：采用TRACER1ab FXc自動化模塊,[11C]C02在Ni催化劑的作用下,于400℃高溫反應,生成11CH4；11CH4與升華的碘在730℃高溫下反應生成11CH3I;11CH3I與Ag-Triflate在190℃下反應生成11C-Triflate-CH3I;11C-Triflate-CH3I與前體6-OH-BTA-0反應生成[11C]6-OH-BTA-1,即[11C]-PIB.用半制備純化后,對[11C]-PIB進行標準質(zhì)量控制。收集臨床診斷為aMCI的17例患者,行MRI和PET/CT檢查,用PMOD軟件對各個腦區(qū)進行分析。結果：采用新模塊改進后自動化合成[11C]-PIB,其比活度、放射性濃度都得到明顯改善,有利于臨床應用,制備的[11C]-PIB澄清透明無沉淀,pH值為6.9-7.0,無菌濾膜通透性壓力≥0.4 MPa,乙醇含量10%,RCP95%,放射性濃度為17.6 mCi/mL,放射性半衰期為20±2 min,比活度為4±0.3 Ci/μmol,細菌學及內(nèi)毒素實驗均為陰性,各項指標均符合SFDA頒布的《正電子放射性藥物質(zhì)量控制指導原則》。17例研究對象經(jīng)過臨床MMSE評分、AVLT延遲回憶、波士頓命名測驗、連線測驗B、動物言語流暢性測驗、臨床癡呆評分和Hachinski缺血評分綜合分析,診斷為aMCI患者。行PET/MRI檢查后,PMOD分析顯示其中13例病人PET/MRI檢查示額葉、頂葉、顳葉、枕葉、楔葉、海馬、扣帶回后部、腦干、丘腦、白質(zhì)等有不同程度[11C]-PIB沉積,以額葉、頂葉、顳葉、枕葉、楔葉、扣帶回后部最明顯,4例這些區(qū)域無明顯[11C]-PIB沉積。PMOD為腦部各腦區(qū)分析提供一種定量方法,[11C]-PIB PET檢查顯示臨床診斷為aMCI的17例病例,其在aMCI篩選的陽性率為76.5%,進一步研究有待于今后隨訪確定。[11C]-PIB PET的臨床方法學研究為今后Tau蛋白顯像的臨床應用提供方法學借鑒。第四部分新型Aβ和Tau分子探針[18F]-TKP的標記、標記條件優(yōu)化及生物學特性研究目的：研制一種有效的分子影像探針[18F]-TKP可以體內(nèi)定量分析Ap和Tau含量水平,以早期診斷和有效評價AD治療效果。方法：制備[18F]-TKP的標準品和標記前體,進行結構鑒定和標準質(zhì)量控制。應用Tracerlab FX N Pro全自動放射性合成模塊探索[18F]-TKP的制備條件,分別比較一鍋法和兩鍋法在制備[18F]-TKP上的優(yōu)劣,完成[18F]-TKP標準質(zhì)量控制,比較兩種制備方法在[18F]-TKP標記產(chǎn)率、合成時間、比活度等的差別。采用MicroPET行C57鼠體內(nèi)定量分析,并用SD大鼠行腦部PET/MRI檢查,用PMOD軟件進行分析,完成[18F]-TKP急性毒性研究。結果：大腦神經(jīng)細胞內(nèi)淀粉樣蛋白和NFTS沉積的有效生物標記物在預測AD高位人群和準確評價正在研發(fā)的AD治療藥物至關重要。本課題研發(fā)了[18F]-TKP的前體、標準品,結構經(jīng)過核磁和質(zhì)譜鑒定,其總體產(chǎn)率分別為80%和70%以上,采用兩種不同的放射性標記方法：一鍋法和兩鍋法,并對總體合成時間、標記產(chǎn)率、比活度、產(chǎn)物放化純、合成的自動化程度等進行比較,綜合比較,選擇兩鍋法。在產(chǎn)物純化上,首先采用tC18 Sep-Pak Vac cartridge小柱除去無機和水溶性雜質(zhì),再用反相半制備液相進一步純化,提取[18F]-TKP,然后將收集的[18F]-TKP再經(jīng)tC18 Sep-Pak Vac cartridge進行固相萃取,純[18F]-TKP用1 mL乙醇洗脫下來(tC18 Sep-Pak Vac cartridge對[18F]-TKP的捕獲能力超過90%),所以用小體積的乙醇即可將[18F]-TKP洗脫下來。這有利于將[18F]-TKP制備成10%乙醇的注射液,仍然保持高比活度。[18F]-TKP質(zhì)量控制符合SFDA頒布的《正電子放射性藥物質(zhì)量控制指導原則》。[18F]-TKP制備全程電腦控制,建立了[18F]-TKP自動化合成工藝路線,如此方案,保證了[18F]-TKP的高放化純,為進一步動物實驗及將來的臨床研究提供了保證。這樣的高濃度注射液在嚙齒類動物實驗中極為關鍵,如此才能保證小體積(250-500 mL)含有足夠的放射性(1-3mCi)。[18F]-TKP將來在臨床應用中也能得到保證,比如10%的乙醇[18F]-TKP溶液用25%人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)稀釋后,能夠保持有效的穩(wěn)定性和溶解性。純品[18F]-TKP用無菌濾膜(0.22mm)進行無菌處理,過濾后無菌濾膜上放射性殘余極低(3-5%的[18F]-TKP放射性),HPLC分析顯示[18F]-TKP的乙醇或生理鹽水、人血清白蛋白溶液穩(wěn)定性較好,可以保持6個小時以上。[18F]-TKP用一鍋法和兩鍋法制備的放化產(chǎn)率、總體制備時間、比活度分別是18±3%(n=6)和25±5%(n=6),45-55 min和55-70 min,0.7±0.2 Ci/μmol和1.5 ± 0.2 Ci/μmol(衰減矯正到靶轟擊結束)。[18F]-TKP是一種靶向研究淀粉樣蛋白和Tau蛋白的潛在PET顯像劑。用PMOD對PET/MRI圖像進行分析,進腦量最高在注射[18F]-TKP后2min,大多數(shù)腦區(qū)的分布差不多,如杏仁核,尾殼核,皮層(皮層聽覺皮質(zhì)扣帶,內(nèi)嗅皮質(zhì),額葉皮質(zhì),大腦島葉皮質(zhì),皮質(zhì)內(nèi)側(cè)前額葉,皮質(zhì)運動,皮層眶額葉,皮質(zhì)軀體感覺,視覺皮層),海馬,丘腦,嗅,中腦腹側(cè)被蓋區(qū),腹側(cè)被蓋區(qū),丘腦整體,垂體和腦橋等。[18F]-TKP隨后被快速洗脫清除,[18F]-TKP注射后30 min達到平臺期,隨后有緩慢的上升,攝取最高的區(qū)域主要在嗅皮層,其次為垂體,杏仁核,下丘腦,腦橋腹側(cè)被蓋區(qū),中腦,海馬,皮質(zhì),尾殼核和丘腦的整體,嗅皮層洗脫最快,其次為海馬和其他皮層區(qū)域。對于皮層而言,內(nèi)嗅皮層攝取最高,清除最緩慢,其次為視覺皮層,大腦島葉皮質(zhì),皮層眶額葉,皮質(zhì)聽覺,扣帶皮質(zhì),額葉皮質(zhì),皮質(zhì)內(nèi)側(cè)前額葉,運動皮層和皮層軀體感覺。[18F]-TKP主要通過肝臟代謝,小鼠急性毒性試驗陰性。第五部分[11C]標記正電子放射性藥物[11C]-TKF的核素標記條件優(yōu)化及生物學特性研究目的：在前期實驗的基礎上,我們設計Tau蛋白的新型探針[11C]-TKF,并進行自動化工藝建立和臨床前期研究。方法：合成[11C]-TKF的標準品CTKF,并進行結構鑒定和質(zhì)量控制。采用’1C-CH3I和11C-Triflate-CH3I兩種方法對[11C]-TKF的標記進行標記優(yōu)化。完成[11C]-TKF的標準質(zhì)量控制。完成[11C]-TKF在正常C57小鼠的體內(nèi)分布和急性毒性研究。結果：成功合成[11C]-TKF的標準品CTKF,核磁結構鑒定吻合,質(zhì)量控制無菌性和內(nèi)毒素檢查均為陰性,純度高達99%。[11C]-TKF采用11CH3I和11C-Triflate-CH3I兩種方法合成,都成功得到了[11C]-TKF,合成后的[11C]-TKF與標準品CTKF混合進樣后,分析性HPLC顯示紫外峰和放射峰都具有高度一致性,保留時間約5.5 min左右,盡管11C-Triflate-CH3I法在11CH3I與Ag-Triflate在190℃下反應生成11C-Triflate-CH3I時多用了5 min時間,11C-Triflate-CH3I法整個制備過程大概需要35-40min,但是合成產(chǎn)率和比活度遠遠高于11CH3I法。兩種方法最后得到的[11C]-TKF注射液pH值接近中性,無菌濾膜通透性壓力≥0.4 MPa,乙醇含量10%,細菌和內(nèi)毒素均為陰性,整個質(zhì)量控制符合SFDA頒布的《正電子放射性藥物質(zhì)量控制指導原則》。正常動物體內(nèi)分布示[11C]-TKF主要通過膽道代謝,總體進腦量較[18F]-THK523理想,并且快速洗脫,急性毒性實驗陰性。值得一提的是,有些參數(shù)必須通過體內(nèi)給藥得到,比如,一個理想是顯像劑體內(nèi)對NFTs的可視化在很大程度上取決于其通過血腦屏障的水平。[11C]-TKF通過血腦屏障的水平比較理想,并且可在正常動物腦內(nèi)快速洗脫。
【關鍵詞】：~(18)F標記 神經(jīng)纖維纏結 β淀粉樣蛋白 阿爾茨海默病 特異性分子探針 正電子發(fā)射計算機斷層掃描 自動化放射性合成 化學動力學 生物學特性
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16;R817.4
【目錄】：

• 縮略詞索引5-8
• 中文摘要8-14
• ABSTRACT14-23
• 前言23-34
• 參考文獻31-34
• 第一章 [~(18)F]-THK523的核素標記及標記條件優(yōu)化34-56
• 1 實驗材料35-37
• 2 實驗方法37-45
• 3 結果與討論45-54
• 4. 本章小結54-55
• 5. 參考文獻55-56
• 第二章 [~(18)F]-THK523的生物學特性研究56-80
• 1 實驗材料56-57
• 2 實驗方法57-64
• 3 結果與討論64-78
• 4 本章小結78
• 5 參考文獻78-80
• 第三章 [~(11)C]-PIB全自動合成及相關顯像研究80-102
• 1 實驗材料81-82
• 2 實驗方法82-87
• 3 結果與討論87-99
• 4. 本章小結99-101
• 5. 參考文獻101-102
• 第四章 新型Aβ和Tau分子探針[~(18)F]-TKP的標記、標記條件優(yōu)化及生物學特性究102-145
• 1 實驗材料103-106
• 2 實驗方法106-118
• 3 結果與討論118-140
• 4. 本章小結140-144
• 5. 參考文獻144-145
• 第五章 [~(11)C]標記正電子放射性藥物[~(11)C]-TKF的核素標記條件優(yōu)化及生物學特性研究145-172
• 1 實驗材料146-147
• 2 實驗方法147-153
• 3 結果與討論153-170
• 4. 本章小結170-172
• 綜述172-186
• 參考文獻181-186
• 博士期間發(fā)表論文和申請課題、專利186-187
• 博士期間參加學習培訓、獎項187-188
• 致謝188-190

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 曹國憲;周杏琴;孔艷艷;張建康;欽曉峰;;NMDA受體顯像劑~(99m)Tc-PQQ酯的藥物動力學研究[J];核技術;2013年01期

2 王學斌,楚進鋒;~(99)Tc~m放射性藥物的分子設計(Ⅰ)[J];同位素;2003年01期

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本文編號：628868