本文關(guān)鍵詞：不同環(huán)境下天然無結(jié)構(gòu)蛋白α-Synuclein的核磁共振研究

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【摘要】：突觸核蛋白α-synuclein(AS)是由140個氨基酸組成的天然無結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)帕金森病的標(biāo)志物——路易小體中含有大量的AS, AS的異常聚集和纖維化被認(rèn)為是引起帕金森病PD的主要原因之一,因而針對該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),聚集和功能的研究一直是研究熱點(diǎn)。 AS由三個部分組成：N端、NAC區(qū)域和C端。生理?xiàng)l件下,AS主要以游離于細(xì)胞質(zhì)中的自由態(tài)為主。近年研究認(rèn)為在溶液中無結(jié)構(gòu)的AS其實(shí)具有部分折疊的結(jié)構(gòu)。因此找到用以探測AS系綜構(gòu)象變化的簡便靈敏探針顯得尤為重要。同時(shí),AS的聚集及纖維化機(jī)制十分復(fù)雜,至今仍不明確�；镜睦w維化過程認(rèn)為是AS由最初無結(jié)構(gòu)狀態(tài)直到形成部分折疊中間態(tài),再到寡聚物的形成,進(jìn)一步形成排列緊密的纖維。AS如何形成中間態(tài)、經(jīng)歷怎樣的構(gòu)象轉(zhuǎn)變、最終形成什么樣的部分折疊態(tài)的研究,能夠?qū)S聚集機(jī)制和纖維化機(jī)制提供重要的線索。近年來的研究發(fā)現(xiàn),AS的聚集和纖維化過程受環(huán)境因素的影響很大,因此,針對不同環(huán)境下AS結(jié)構(gòu)的研究具有重要的意義。 本文針對以上的問題,對天然無結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)AS做了比較系統(tǒng)的研究。首先介紹了AS制備純化的方法,包括未標(biāo)記、非特異性同位素標(biāo)記和19F特殊標(biāo)記三種蛋白質(zhì)標(biāo)記方法。此外,我們通過體積排阻色譜和熒光監(jiān)測相結(jié)合的手段摸索AS寡聚物制備的條件,制備并分離出了AS寡聚物。 運(yùn)用’9F探釗,通過一維19F NMR方法能夠更靈敏和直觀地探測AS的構(gòu)象變化。我們發(fā)現(xiàn)在低鹽環(huán)境下AS出現(xiàn)了兩種不同的構(gòu)象,在氟譜上表現(xiàn)為譜圖出現(xiàn)明顯的兩套譜峰。通過運(yùn)用改變重水含量的溶劑誘導(dǎo)的同位素效應(yīng)方法,我們鑒別了兩種態(tài)的結(jié)構(gòu)區(qū)別：一種折疊相對緊密,一種相對打開。此外,我們還提供了可能參與分子內(nèi)相互作用而造成這種結(jié)構(gòu)區(qū)別的殘基信息。 我們通過向AS溶液中加入不同類型,不同比例的有機(jī)溶劑模擬細(xì)胞膜界面的環(huán)境,研究該環(huán)境下AS的結(jié)構(gòu),以及AS和細(xì)胞膜結(jié)合的結(jié)構(gòu),并且捕捉一些部分折疊中間態(tài)。結(jié)合氟譜、HSQC、譜峰強(qiáng)度比較、圓二色光譜等方法,我們觀察到了AS在不同環(huán)境下構(gòu)象的變化以及相應(yīng)構(gòu)象變化可能的折疊過程。同時(shí)在甲醇與水混合體系中,低甲醇含量(15%)的情況下可以觀察到AS部分折疊中間態(tài),形成這種部分折疊中間態(tài)被認(rèn)為是AS聚集纖維化的重要過程。 本文的研究結(jié)果對于理解AS在溶液中的狀態(tài),以及AS的寡聚機(jī)制和纖維化機(jī)制有著重要的參考價(jià)值。本文運(yùn)用超靈敏19F探針探測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和捕捉部分折疊中間態(tài)的實(shí)驗(yàn)方法,可以為其它天然無結(jié)構(gòu)蛋白的研究提供參考依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：液體核磁共振 氟譜 天然無結(jié)構(gòu)蛋白 帕金森病 α-synuclein
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院（武漢物理與數(shù)學(xué)研究所）
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：Q51;R749.16
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 目錄9-12
• 1 引言12-23
• 1.1 天然無結(jié)構(gòu)蛋白α-Synuclein簡述12-16
• 1.1.1 天然無結(jié)構(gòu)蛋白在生命體中廣泛存在12
• 1.1.2 天然無結(jié)構(gòu)蛋白AS被認(rèn)為與帕金森病密切相關(guān)12-13
• 1.1.3 AS在生理?xiàng)l件下主要以無結(jié)構(gòu)形式存在13
• 1.1.4 AS與細(xì)胞膜相互作用時(shí)會出現(xiàn)不同的結(jié)構(gòu)13-14
• 1.1.5 AS易于纖維化,形成的纖維是路易小體的主要成分14-15
• 1.1.6 影響AS聚集的多方面因素15-16
• 1.2 核磁共振波譜學(xué)是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的手段16-22
• 1.2.1 核磁共振簡介18-19
• 1.2.2 化學(xué)位移19-20
• 1.2.3 氟NMR譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用20-22
• 1.3 小結(jié)22-23
• 2 天然無結(jié)構(gòu)蛋白AS樣品的制備23-28
• 2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化24
• 2.2 未標(biāo)記AS的表達(dá)24
• 2.3 同位素標(biāo)記的AS的表達(dá)24-25
• 2.4 ~(19)F、 ~(15)N標(biāo)記的AS的表達(dá)25
• 2.5 蛋白樣品的純化25-28
• 3 低鹽與高鹽環(huán)境下AS構(gòu)象的NMR研究28-33
• 3.1 單體AS在溶液中不是完全無結(jié)構(gòu)的28-29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法和參數(shù)29
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-31
• 3.3.1 AS在低鹽與高鹽溶液中存在不同構(gòu)象29-30
• 3.3.2 通過溶劑誘導(dǎo)的同位素位移鑒別結(jié)構(gòu)差異30-31
• 3.4 討論31-32
• 3.5 小結(jié)32-33
• 4 含有機(jī)溶劑體系下AS的結(jié)構(gòu)研究33-42
• 4.1 有機(jī)溶劑的加入能夠模擬生物膜環(huán)境33-34
• 4.2 氟譜對環(huán)境十分敏感是研究結(jié)構(gòu)變化很好的探針34
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法和參數(shù)34
• 4.4 結(jié)果與討論34-40
• 4.4.1 圓二色光譜實(shí)驗(yàn)34-35
• 4.4.2 ~1H-~(15)N HSQC實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-39
• 4.4.3 一維~(19)F譜實(shí)驗(yàn)39-40
• 4.5 討論40-41
• 4.6 小結(jié)41-42
• 5 碩士期間開展的其他工作42-56
• 5.1 對AS寡聚物的研究42-49
• 5.1.1 AS寡聚物更可能是帕金森病的病因42-44
• 5.1.2 ~(14)N四極裂分能夠反映結(jié)構(gòu)變化44-46
• 5.1.3 實(shí)驗(yàn)方法46
• 5.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-49
• 5.2 硒元素細(xì)胞內(nèi)代謝初步研究49-52
• 5.2.1 硒元素在細(xì)胞中的代謝49-50
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)方法50
• 5.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論50-52
• 5.3 ~(14)N-四極耦合常數(shù)測定序列調(diào)試52-56
• 5.3.1 組氨酸有多種存在形式52-53
• 5.3.2 ~(14)N四極耦合常數(shù)有多種測定方法53-54
• 5.3.3 樣品制備及實(shí)驗(yàn)方法54-55
• 5.3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55
• 5.3.5 小結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-64
• 附錄64-68
• 附錄A 圓二色光譜操作64
• 附錄B 熒光監(jiān)測AS纖維化過程64-65
• 附錄C BCA檢測蛋白質(zhì)濃度65
• 附錄D 蛋白純化時(shí)所用緩沖溶液配方65
• 裂菌緩沖液(lysis buffer)65
• 陰離子交換柱(Source Q)65
• S100分子篩65
• 附錄E 所用培養(yǎng)基及蛋白和核酸電泳膠配方65-68
• 常規(guī)培養(yǎng)基配方65-66
• SDS-PAGE濃縮膠和分離膠配方66-68
• 作者簡介及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果68

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