本文關(guān)鍵詞：TDP-43對(duì)tau外顯子10可變剪接和tau mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)的研究

  更多相關(guān)文章： TDP-43 tau 可變剪接 蛋白激酶 阿爾茨海默病

【摘要】：第一部分TDP-43在tau外顯子10可變剪接中的作用 目的： 研究TDP-43（transactive response DNA-binding protein of43kDa）對(duì)tau外顯子10可變剪接的影響及其分子機(jī)制。 方法： 利用tau的迷你基因pCI/SI-SI10和pCI/SI9-LI10，研究TDP-43調(diào)節(jié)tau外顯子10可變剪接的機(jī)制。構(gòu)建TDP-43真核表達(dá)質(zhì)粒，在SH-SY5Y、N2a、HepG2、HEK-293FT、COS7、HeLa細(xì)胞和原代皮層神經(jīng)元內(nèi)過(guò)表達(dá)TDP-43，在HEK-293FT細(xì)胞中表達(dá)不同濃度的TDP-43或基因沉默TDP-43，利用RT-PCR方法研究TDP-43對(duì)tau外顯子10可變剪接的影響。構(gòu)建TDP-43的截?cái)囿w及肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和泛素陽(yáng)性包涵體額顳葉癡呆（frontotemporallobar degeneration with ubiquitin-positive inclusions，F(xiàn)TLD U）相關(guān)的TDP-43突變體，研究其對(duì)tau外顯子10可變剪接的影響的結(jié)構(gòu)域依賴性和ALS/FTLD-U病理相關(guān)性突變對(duì)TDP-43調(diào)節(jié)tau外顯子10可變剪接的影響。利用RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)原理探討TDP-43與tau pre-mRNA結(jié)合的可能位點(diǎn)。 結(jié)果： 1) HEK-293FT細(xì)胞內(nèi)，過(guò)表達(dá)TDP-43可以促進(jìn)tau外顯子10的編碼，增加4R-tau的表達(dá)，這種促進(jìn)作用呈劑量依賴性。在SH-SY5Y、N2a、HepG2、COS7、HeLa細(xì)胞和原代皮層神經(jīng)元中，TDP-43都可以促進(jìn)tau外顯子10的編碼。 2) TDP-43除了已經(jīng)報(bào)道的一個(gè)核定位信號(hào)外，可能還含有另外一個(gè)核定位信號(hào)。 3) TDP-43的C-末端是其促進(jìn)tau外顯子10編碼的生物學(xué)功能所必需的，但N-末端對(duì)其功能有促進(jìn)作用。 4) ALS或FTLD-U疾病相關(guān)的TDP-43突變體促進(jìn)4R-tau表達(dá)的能力比野生型TDP-43更強(qiáng)。 5) tau迷你基因的pre-mRNA上可能存在6個(gè)潛在的TDP-43結(jié)合位點(diǎn)，這6個(gè)位點(diǎn)都位于內(nèi)含子9上。 結(jié)論： 本研究顯示TDP-43可能通過(guò)與tau pre-mRNA的結(jié)合促進(jìn)tau外顯子10的可變剪接。 第二部分 蛋白激酶和磷酸酯酶對(duì)TDP-43介導(dǎo)的tau外顯子10可變剪接的調(diào)節(jié) 目的： 研究蛋白激酶和磷酸酯酶對(duì)TDP-43的磷酸化和去磷酸化及對(duì)TDP-43介導(dǎo)的促進(jìn)tau外顯子10的可變剪接作用的影響。 方法： 免疫共沉淀方法檢測(cè)TDP-43和哪些蛋白激酶、磷酸酯酶之間有相互作用。在HEK-293FT細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TDP-43和酪蛋白激酶1（casein kinase，CK）或蛋白激酶A（cAMP dependent kinase，PKA），分別免疫純化TDP-43、CK1和PKA,用CK1和PKA體外磷酸化TDP-43，放射自顯影檢測(cè)蛋白激酶對(duì)TDP-43的磷酸化或磷酸酯酶對(duì)TDP-43介導(dǎo)的tau外顯子10的可變剪接有無(wú)影響。我們構(gòu)建了磷酸化位點(diǎn)相關(guān)的突變體（TDP-43S379A，TDP-43S403/404A，TDP-43S409/410A），通過(guò)放射自顯影觀察突變后的TDP-43的磷酸化水平和野生型TDP-43相比有無(wú)改變。用PKA激活劑Forskolin或CK1抑制劑PF4800567或PP1抑制劑處理轉(zhuǎn)染了TDP-43的細(xì)胞，觀察其對(duì)TDP-43蛋白磷酸化的影響。 結(jié)果： 1) TDP-43和CK1、CK1有相互作用。CK1和能在體外磷酸化TDP-43。CK1抑制劑PF4800567處理能下調(diào)TDP-43的磷酸化水平。CK1抑制TDP-43促進(jìn)的tau外顯子10的可變剪接。 2) TDP-43和PKA c、PKAc有相互作用。PKAc和能在體外磷酸化TDP-43。PKA激活劑Forskolin處理使TDP-43磷酸化水平上升。PKA抑制TDP-43促進(jìn)的tau外顯子10的可變剪接。 3) PP1可使TDP-43的多個(gè)位點(diǎn)去磷酸化，抑制劑處理后磷酸化水平顯著上升。PP1能抑制TDP-43促進(jìn)的tau外顯子10的可變剪接。 4)阿爾茨海默�。ˋlzheimer's disease，AD）患者腦組織檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TDP-43的pS403/404、pS409/410水平增加，3R-tau的表達(dá)也增加。 結(jié)論： TDP-43的活性受蛋白激酶（CK1和PKA）和磷酸酯酶（PP1）影響，改變其磷酸化水平，抑制其促進(jìn)tau外顯子10可變剪接的作用。 第三部分 TDP-43調(diào)節(jié)tau mRNA的穩(wěn)定性 目的： 研究TDP-43對(duì)tau mRNA的穩(wěn)定性的影響。 方法： 檢測(cè)N2a細(xì)胞中內(nèi)源性tau的水平，用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D處理轉(zhuǎn)染了TDP-43的細(xì)胞，觀察其對(duì)tau mRNA水平的影響。構(gòu)建tau3’-非翻譯區(qū)（3’-untranslated region,3’-UTR）質(zhì)粒及其缺失突變體（缺失TDP-43和tau3’-UTR可能結(jié)合的TG重復(fù)序列）到pEGFP-C1載體上。HEK-293FT細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)TDP-43，和tau3’-UTR質(zhì)�；蛉笔蛔凅w共轉(zhuǎn)，光鏡下觀察綠色熒光的變化，，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GFP的表達(dá)，Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。TDP-43和PKA或CK1共轉(zhuǎn)，觀察tau3’-UTR的表達(dá)有無(wú)變化。 結(jié)果： 1) TDP-43降低N2a細(xì)胞中內(nèi)源性tau水平，siTDP-43作用相反。放線菌素D處理后，TDP-43仍能顯著降低tau mRNA水平。 2) HEK-293FT細(xì)胞內(nèi)，TDP-43可以呈劑量依賴性下調(diào)tau3’-UTR的表達(dá)，抑制tau mRNA的穩(wěn)定性。 3) TG重復(fù)序列是TDP-43抑制tau mRNA的穩(wěn)定性所必需的。 4) CK1或PKA和TDP-43共同作用能逆轉(zhuǎn)TDP-43對(duì)tau3’-UTR表達(dá)的抑制作用。 結(jié)論： TDP-43可能通過(guò)和tau3’-UTR的(TG)n位點(diǎn)結(jié)合，抑制tau mRNA的穩(wěn)定性。CK1和PKA逆轉(zhuǎn)TDP-43對(duì)tau3’-UTR表達(dá)的抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：TDP-43 tau 可變剪接 蛋白激酶 阿爾茨海默病
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-13
• 前言13-17
• 第一部分 TDP-43 在 tau 外顯子 10 可變剪接中的作用17-40
• 1. 材料和方法17-28
• 2. 結(jié)果28-37
• 3. 討論37-39
• 4. 結(jié)論39-40
• 第二部分 蛋白激酶和磷酸酯酶對(duì)TDP-43 介導(dǎo)的 tau 外顯子 10 可變剪接的調(diào)節(jié)40-79
• 1. 材料和方法41-50
• 2. 結(jié)果50-76
• 3. 討論76-78
• 4. 結(jié)論78-79
• 第三部分 TDP-43 對(duì) tau mRNA 穩(wěn)定性的影響79-92
• 1. 材料和方法80-84
• 2. 結(jié)果84-89
• 3. 討論89-91
• 4. 結(jié)論91-92
• 總結(jié)92-93
• 參考文獻(xiàn)93-100
• 綜述100-113
• 參考文獻(xiàn)108-113
• 英文縮寫詞表113-115
• 附錄115-117
• （一）博士期間發(fā)表和參與研究工作的論文115-116
• （二）博士期間參與的學(xué)術(shù)會(huì)議116
• （三）博士期間參與的基金項(xiàng)目116
• （四）博士期間訪學(xué)經(jīng)歷116-117
• 致謝117-119

【共引文獻(xiàn)】

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