本文關(guān)鍵詞：MK-801致幼鼠額葉皮層神經(jīng)元興奮性降低和成年后社會交往缺陷的機(jī)制研究及帕潘立酮的干預(yù)作用

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【摘要】：精神分裂癥(schizophrenia, SCZ)是一種遷延終生,難以治愈的重大精神疾患,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。流行病學(xué)調(diào)查顯示約1%的世界人口患有精神分裂癥,給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。SCZ的主要臨床癥狀包括幻覺、妄想、狂躁亢奮等陽性癥狀；情感淡漠、社會交往缺陷甚至社會退縮等陰性癥狀；以及注意力不集中等認(rèn)知功能損害。陰性癥狀病程隱匿持久,常成為SCZ某一階段最重要的癥狀,是預(yù)測SCZ嚴(yán)重程度的最顯著指標(biāo),也成為SCZ研究的關(guān)鍵點(diǎn)和難點(diǎn)。SCZ的致病機(jī)制復(fù)雜,目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為,SCZ是遺傳、環(huán)境和社會心理因素及其交互作用的結(jié)果。近年來,越來越多的證據(jù)顯示神經(jīng)發(fā)育,尤其是皮層的發(fā)育異常是SCZ重要的致病因素。多數(shù)SCZ患者早在幼年時期就已出現(xiàn)輕微的精神和行為異常；胚胎、嬰幼兒期神經(jīng)損傷及負(fù)性刺激常引起成年SCZ；起源于神經(jīng)外胚層的顏面部微小軀體異常與SCZ密切相關(guān)。這些證據(jù)都提示了精神分裂與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)。在腦皮層結(jié)構(gòu)中,額葉皮層占據(jù)體積最大,在進(jìn)化上最新,負(fù)責(zé)認(rèn)知、情感、語言和社會交往等高級神經(jīng)活動。一般認(rèn)為,思維貧乏、情感淡漠和社會交往缺陷等陰性癥狀定位于腦額葉。神經(jīng)病理學(xué)的研究證實(shí)SCZ患者在兒童早期即存在腦皮質(zhì)變薄、神經(jīng)纖維聯(lián)系減少等形態(tài)學(xué)改變；干預(yù)實(shí)驗(yàn)動物皮層發(fā)育可以導(dǎo)致SCZ類似癥。這些證據(jù)則揭示了皮層發(fā)育異常是精神分裂的重要致病因素。據(jù)此,神經(jīng)學(xué)者提出了神經(jīng)發(fā)育假說,在腦發(fā)育期,來自遺傳、環(huán)境或其他因素的影響干擾了神經(jīng)元發(fā)育成熟、突觸建立的發(fā)育軌跡,由此導(dǎo)致皮層的神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)和功能傷害在青春期及成年期逐漸顯現(xiàn)神經(jīng)和精神癥狀。目前,從神經(jīng)發(fā)育角度揭示SCZ致病的分子機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。SCZ的發(fā)病與多種神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān),如多巴胺(dopamine, DA),谷氨酸(glutamate, Glu)和γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GAB A)等,并由此提出多種SCZ病因?qū)W說。過去數(shù)十年的研究發(fā)現(xiàn),DA功能亢進(jìn)雖可較好的解釋SCZ陽性癥狀,但難以闡明其陰性癥狀。近年來,基于N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體功能低下導(dǎo)致的Glu功能紊亂學(xué)說逐漸引起學(xué)者關(guān)注。該學(xué)說較好的解釋了SCZ陽性和陰性癥狀以及SCZ的進(jìn)展演變過程。多種NMDA受體抑制劑,如地佐環(huán)平(dizocilpine, MK-801),苯環(huán)己哌啶(phencyclidine, PCP)等,可使健康志愿者產(chǎn)生SCZ癥狀。因此,NMDA受體抑制劑,尤其是MK-801被廣泛應(yīng)用于SCZ動物模型的制作及研究。在這種動物模型上,不僅可誘導(dǎo)出刻板行為、自發(fā)活動加強(qiáng),還可檢測出記憶障礙及社會交往行為減少等表現(xiàn),較好的模擬了SCZ患者陽性及陰性癥狀。同時,在模型動物前額葉還檢測到神經(jīng)元損傷、神經(jīng)突起數(shù)目減少等形態(tài)學(xué)改變、以及興奮性和抑制性遞質(zhì)失衡。SCZ病人的尸檢研究也發(fā)現(xiàn)額葉皮層神經(jīng)元形態(tài)改變,包括樹突棘密度降低、突起長度以及突起數(shù)目均明顯減少。以上證據(jù)支持NMDA受體阻斷劑誘導(dǎo)動物模型與SCZ之間有較好的吻合性。NMDA受體在腦發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用,其表達(dá)高峰期也是腦內(nèi)神經(jīng)元生長及突觸聯(lián)系建立的關(guān)鍵期。嚙齒類動物則在生后腦內(nèi)NMDA受體大量表達(dá),并在第7天達(dá)到峰值。嚙齒類動物腦的快速生長期也在生后14天內(nèi),表現(xiàn)為腦體積增大、伴隨腦內(nèi)過量神經(jīng)元生成及自然凋亡,大量突觸產(chǎn)生并選擇性修剪。這一時期也是依賴NMDA受體腦發(fā)育的敏感期,在這一階段阻斷NMDA受體必然會干擾腦發(fā)育的正常軌跡,引發(fā)精神異常。因此,生后NMDA受體阻斷建立的神經(jīng)發(fā)育動物模型是建立在SCZ神經(jīng)發(fā)育異常假說和谷氨酸功能紊亂學(xué)說基礎(chǔ)上的最理想的研究模型,較成年模型而言,能更好的模擬SCZ。盡管已有關(guān)于SCZ發(fā)育模型腦遞質(zhì)代謝、認(rèn)知障礙及病理學(xué)改變的報道,但幼鼠NMDA受體阻斷后對額葉神經(jīng)元興奮性的影響尚不明確；發(fā)育模型鼠成年后精神癥狀,尤其是社會交往缺陷等陰性癥狀的行為學(xué)尚需進(jìn)一步評價；新型非經(jīng)典抗精神病藥物的療效也亟待闡明。微小RNA(microRNAs)是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA,可通過與靶基因3’非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對,在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)。已發(fā)現(xiàn)多數(shù)miRNAs與神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)精神源性疾病有關(guān)。miR-134是一種腦內(nèi)特異性表達(dá)的microRNA,可調(diào)節(jié)樹突棘的大小及形狀,從而改變突觸功能。在腦發(fā)育過程中,miR-134的表達(dá)與NMDA受體的表達(dá)峰值的時間和位置一致,并且NMDA處理可以導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)miR-134表達(dá)上調(diào)。研究表明,精神分裂癥患者背外側(cè)額葉皮層miR-134表達(dá)上調(diào),提示miR-134與患者認(rèn)知障礙、社會交往缺陷等陰性癥狀有關(guān)。此外,miR-134的相關(guān)基因SIRT1也與神經(jīng)發(fā)育及精神疾病相關(guān)。SIRT1是NAD+依賴的組蛋白去乙�；�,在胚胎神經(jīng)管內(nèi)高表達(dá),可調(diào)節(jié)腦皮層神經(jīng)元發(fā)育,減少神經(jīng)元凋亡。SIRT1還與神經(jīng)元興奮性密切相關(guān),其激動劑可增加神經(jīng)細(xì)胞的興奮性。單核苷酸多態(tài)性(SNP)研究也顯示SIRT1與精神分裂癥相關(guān),并且NMDA受體阻斷劑美金剛可以減弱谷氨酸導(dǎo)致的SIRT1表達(dá)異常。這些結(jié)果揭示了miR-134和SIRT1都與精神分裂密切相關(guān),但是miR-134和SIRT1是否參與了MK-80I誘導(dǎo)的幼鼠腦皮層神經(jīng)損傷以及由此導(dǎo)致的成年鼠社會行為缺陷,尚待進(jìn)一步的研究。帕潘立酮是新一代的非經(jīng)典抗精神病藥物,能顯著改善青年和中年SCZ患者的陽性和陰性癥狀,其中,改善陰性癥狀療效更顯著。臨床研究也證實(shí)了帕潘立酮能明顯治療患者社會功能缺陷,療效優(yōu)于經(jīng)典藥物利培酮。近年來研究發(fā)現(xiàn),帕潘立酮還具有直接的神經(jīng)保護(hù)作用,可保護(hù)β-淀粉樣蛋白損傷的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞；降低多巴胺導(dǎo)致的SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞中Caspase-3的蛋白表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)室先前的研究也發(fā)現(xiàn),帕潘立酮可體外保護(hù)損傷的神經(jīng)元,但是,帕潘立酮對MK-801導(dǎo)致的幼鼠腦皮層神經(jīng)損傷是否有保護(hù)作用,以及能否改善損傷幼鼠成年后社會交往缺陷尚未完全闡明�；谏鲜隼砟�,我們設(shè)計(jì)了本項(xiàng)實(shí)驗(yàn),分三部分：在細(xì)胞水平上,培養(yǎng)新生鼠原代腦皮層神經(jīng)元,探討MK-801導(dǎo)致神經(jīng)元活性損傷和興奮性降低的分子機(jī)制；在動物水平上,建立MK-801損傷幼鼠神經(jīng)發(fā)育模型,利用腦片鉗和新生鼠腦內(nèi)基因電轉(zhuǎn)技術(shù)分析MK-801誘導(dǎo)幼鼠額葉皮層神經(jīng)元興奮性變化及突觸功能損傷的分子機(jī)制：從行為學(xué)變化上,通過MiceProfiler,一種新的視頻分析軟件,評價MK-801幼年損傷鼠成年后的社會交往行為缺陷,并均給予帕潘立酮處理,檢測其治療效果。第一部分：NIK-801誘導(dǎo)培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元損傷的分子機(jī)制及帕潘立酮的神經(jīng)保護(hù)作用首先,我們檢測了MK-801對于原代培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元活性的影響。取材并培養(yǎng)新生鼠腦皮層神經(jīng)元,給予50、100和200μM濃度的MK-801處理,發(fā)現(xiàn)隨濃度增加,神經(jīng)元胞體逐漸變圓,突起縮短、斷裂。CCK-8檢測結(jié)果顯示,MK-801導(dǎo)致細(xì)胞活性降低；乳酸脫氫酶LDH釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示MK-801致使LDH釋放增多,導(dǎo)致細(xì)胞損傷。隨后又在培養(yǎng)基內(nèi)加入1、10和50μM的帕潘立酮,10μM的帕潘立酮可減輕神經(jīng)元損傷,CCK-8與LDH檢測結(jié)果顯示細(xì)胞活性增加(P0.05和P0.01)。為檢測培養(yǎng)神經(jīng)元的興奮性變化,我們使用單細(xì)胞膜片鉗記錄了細(xì)胞膜電位和誘發(fā)動作電位變化情況。使用100μM的MK-801處理后,神經(jīng)元的的自發(fā)去極化完全消失,并且帕潘立酮不能改變MK-801的抑制作用；通過給予電流注射,檢測誘發(fā)產(chǎn)生的動作電位,顯示MK-801處理后,誘發(fā)電位幅度較對照組顯著降低(P0.01),而帕潘立酮可減弱MK-801的抑制作用(P0.05)；為揭示帕潘立酮提高神經(jīng)興奮性的機(jī)制,檢測了神經(jīng)元Ih電流的變化,Ih電流是由鉀離子內(nèi)流產(chǎn)生的內(nèi)向電流,可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元動作電位的產(chǎn)生。結(jié)果顯示帕潘立酮處理組的Ih電流幅度明顯小于MK-801處理組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),說明帕潘立酮可以抑制去極化電流,超極化膜電位。然后,我們分析了神經(jīng)元損傷及興奮性降低的分子機(jī)制。實(shí)時定量PCR顯示MK-801抑制SIRT1表達(dá)并增加miR-134表達(dá)(均P0.01)。給予10μM帕潘立酮處理可明顯升高SIRT1表達(dá)并降低miR-134表達(dá)(均P0.01)；Western blot顯示帕潘立酮可升高SIRT1蛋白水平,與RT-PCR結(jié)果一致。最后,為進(jìn)一步證實(shí)SIRT1/miR-134在帕潘立酮對抗MK-801導(dǎo)致神經(jīng)損傷中的作用,我們先給予尼克酰胺抑制SIRT1活性,細(xì)胞活性結(jié)果顯示抑制SIRT1活性后可減弱帕潘立酮的保護(hù)作用；沉默miR-134表達(dá),可顯著降低MK-801導(dǎo)致的細(xì)胞損傷作用。上述結(jié)果表明miR-134和SIRT1分子通路參與了帕潘立酮保護(hù)神經(jīng)元、對抗MK-801誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的生物學(xué)作用。本部分結(jié)果顯示,MK-801降低培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元活性,誘導(dǎo)神經(jīng)損傷,激活I(lǐng)h電流降低神經(jīng)興奮性；帕潘立酮可抑制Ih電流部分恢復(fù)神經(jīng)元的興奮性,并通過調(diào)節(jié)SIRT1/miR-134分子通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。第二部分：帕潘立酮對NK-801導(dǎo)致幼鼠額葉皮層神經(jīng)元興奮性降低的干預(yù)機(jī)制分析在上部分實(shí)驗(yàn)針對體外培養(yǎng)神經(jīng)元研究的基礎(chǔ)上,本部分實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MK-801皮下注射建立了SCZ神經(jīng)發(fā)育動物模型,研究MK-801對幼鼠額葉神經(jīng)元興奮性損傷及帕潘立酮的干預(yù)作用。首先采用腦片鉗技術(shù)記錄了額葉皮層神經(jīng)元白發(fā)動作電位和和誘發(fā)動作電位的變化。對照組可檢測到穩(wěn)定的自發(fā)動作電位,平均幅度為71.56±1.11mV,給予MK-801處理后,電位幅度迅速降為3.0-1.66mV,明顯小于對照組(P0.01)。在帕潘立酮處理組中,白發(fā)動作電位的幅度徹底恢復(fù)并躍升為74.14±10.23mV(P0.01)。在MK-801損傷自發(fā)動作電位幅度近95%的情況下,帕潘立酮完全恢復(fù)白發(fā)動作電位幅度,甚至輕微高于對照組,說明帕潘立酮可顯著增加自發(fā)動作電位的幅度,提高神經(jīng)興奮性。同樣,相比對照組,MK-801降低了自發(fā)動作電位的頻率(P0.05),而帕潘立酮明顯增加自發(fā)動作電位的頻率(P0.05)。然后,給予-200pA到200pA、每次10pA的步階電流注射,分析了誘發(fā)動作電位變化,對照組誘發(fā)電位幅度為77.48±4.30mV；給予MK-801處理后,幅度明顯降低(P0.01)；在帕潘立酮組中神經(jīng)元誘發(fā)電位幅度明顯增加(P0.05),恢復(fù)至對照組的92%,幾乎完全恢復(fù)MK-801降低的電位幅度。同時分析了誘發(fā)電位的時程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)；MK-801可增加誘發(fā)電位的時程(P0.01),但帕潘立酮能逆轉(zhuǎn)這種改變(P0.01)。這些結(jié)果均表明MK-801通過阻斷NMDA受體降低皮層神經(jīng)元興奮性,而帕潘立酮可完全逆轉(zhuǎn)MK-801導(dǎo)致的興奮性損傷。最后,我們還進(jìn)一步研究了MK-801以及帕潘立酮對于額葉皮層突觸功能的影響,發(fā)現(xiàn)了MK-801可以降低自發(fā)抑制性突觸后電流(sIPSC)的幅度和頻率(P0.05和P0.001),而帕潘立酮只能改變sIPSC的幅度(P0.05),對于頻率無明顯影響。在第一部分的研究中,我們發(fā)現(xiàn)SIRT1/miR-134參與了MK-801對培養(yǎng)的腦皮層神經(jīng)元的損傷,那么,SIRT1和miR-134是否參與了MK-801導(dǎo)致的神經(jīng)元興奮性損傷?為此,我們?nèi)∧Ｐ褪箢~葉腦組織經(jīng)實(shí)時定量PCR檢測了SIRTl和miR-134的表達(dá)變化。結(jié)果顯示MK-801抑制SIRT1表達(dá)并升高miR-134表達(dá)水平(均P0.05)；Western blot顯示,SIRT1蛋白表達(dá)降低(P0.05)；而帕潘立酮處理鼠中SIRT1表達(dá)升高并且miR-134的表達(dá)降低(均P0.05)。SCZ發(fā)育模型鼠結(jié)果與體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元結(jié)果一致。為進(jìn)一步驗(yàn)證SIRT1/miR-134分子通路在MK-801損傷幼鼠皮層神經(jīng)元中的作用,我們使用了一種新的基因干擾技術(shù)：新生鼠腦內(nèi)基因電轉(zhuǎn)進(jìn)行了后續(xù)的研究。合成SIRT1或miR-134的shRNA干擾片段,分別插入到到GV1 13的Agel, EcoRI和GV249載體的BamHI,HindⅢ酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建GV113-shRNA-SIRT1和GV249-shRNA-miR-134干擾載體,通過ECM830細(xì)胞電穿孔儀在新生鼠腦內(nèi)實(shí)施方波電轉(zhuǎn)導(dǎo)入額葉皮層神經(jīng)元,分別特異性沉默miR-134和SIRT1基因表達(dá),然后采用腦片鉗技術(shù)分別記錄并分析GV113-shRNA-SIRT1和GV249-shRNA-miR-134干擾載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的興奮性變化。結(jié)果顯示,SIRT1沉默后,誘發(fā)動作電位幅度明顯低于對照組(P0.01),但是動作電位的時程沒有發(fā)生變化。這些結(jié)果與MK-801對于神經(jīng)元的作用部分相似,證明MK-801對于神經(jīng)元的部分作用是通過調(diào)節(jié)SIRT1實(shí)現(xiàn)的。在實(shí)驗(yàn)中我們還通過檢測自發(fā)抑制性突觸后電流(sIPSC)和微小興奮性突觸后電流(mEPSC)的變化,進(jìn)一步分析了神經(jīng)突觸功能變化及損傷情況。結(jié)果顯示,GV113-shRNA-SIRT1轉(zhuǎn)染神經(jīng)元s1PSC的幅度(14.39±7.32pA)和頻率(0.07±0.04Hz)均明顯小于對照組(80.70±4.04pA和1.86±0.22Hz),并且具有明顯差異(均P0.001)。GV249-shRNA-miR-134轉(zhuǎn)染神經(jīng)元中,記錄mEPSC幅度(9.82-±1.09pA)明顯高于對照組(3.65±1.25pA),頻率(2.64±0.26Hz)也高于對照組(0.81±0.21Hz),有顯著性差異(P0.05和P0.01)。上述結(jié)果顯示,MK-801阻斷幼鼠NMDA受體后,降低了腦皮層神經(jīng)元自發(fā)放電的頻率和幅度,降低白發(fā)動作電位的幅度和頻率,并降低誘發(fā)動作電位的幅度,但增加時程延遲去極化恢復(fù)時間。新型抗精神病藥物帕潘立酮可提高神經(jīng)興奮性,改善MK-801導(dǎo)致的神經(jīng)元興奮性損傷。通過新生鼠腦內(nèi)基因電轉(zhuǎn)技術(shù),可靠的證實(shí)了帕潘立酮通過調(diào)節(jié)SIRT1/miR-134的表達(dá)來提高神經(jīng)元興奮性,并調(diào)節(jié)mEPSC和sIPSC改善突觸功能。第三部分：NK-801損傷幼鼠成年后社會交往缺陷行為分析及帕潘立酮的治療作用社會交往缺陷是精神分裂癥重要的陰性癥狀,也是研究的難點(diǎn)。在第二部分實(shí)驗(yàn)分析了MK-801導(dǎo)致幼鼠額葉皮層神經(jīng)興奮性抑制的基礎(chǔ)上,本部分實(shí)驗(yàn)旨在檢測MK-801損傷幼鼠成年后社會交往行為的變化及帕潘立酮的治療作用。在SCZ動物模型中,社會交往行為表現(xiàn)復(fù)雜且難以檢測與分析。本實(shí)驗(yàn)采用了一種新檢測分析技術(shù),經(jīng)視頻記錄通過MiceProfiler軟件分析,可客觀準(zhǔn)確地分析動物自由活動、非標(biāo)記狀態(tài)下的社會交往行為。目前尚未見這方面的研究報道。為此,我們先檢測了MK-801建立的成年SCZ模型鼠的的社會交往行為變化,一是評價MiceProfiler軟件是否適用于SCZ的社會交往行為缺陷動物模型；二是檢測帕潘立酮的治療作用。成年鼠檢測結(jié)果顯示,SCZ模型鼠接觸次數(shù)和接觸時間較對照組明顯減少(P0.05和P0.01),在動物交往最明顯的前4min內(nèi),對照組接觸次數(shù)為52.40±5.52次,明顯高于MK-801處理組的23.80±2.13次(P0.05),給予帕潘立酮治療后接觸次數(shù)增加至41.00±3.05次(P0.05)；對照組小鼠的接觸時間為40.82±6.24s,MK-801組明顯下降為19.83±4.23s(P0.01),給予帕潘立酮治療后,可增加接觸時間到32.42±.53s(P0.01)。提示SCZ模型鼠社會交往行為減少,較好的模擬了情感淡漠的SCZ表現(xiàn)。MiceProfiler分析軟件還精確的記錄了動物間近距離位置事件(相互間距離小于3cm)和逃避行為。MK-801組近距離位置事件的次數(shù)和時間均較對照組明顯減少(P0.05和P0.001)。SCZ模型鼠在同伴靠近時表現(xiàn)明顯的逃避行為(主動遠(yuǎn)離靠近的同伴,避免接觸),較正常鼠發(fā)生逃避行為的次數(shù)顯著增加(P0.05),暗示了SCZ鼠的社會退縮行為。令人興奮的是,新型抗精神病藥物帕潘立酮明顯增加近距離位置事件(P0.05),并減少逃避行為發(fā)生的次數(shù)和時長(P0.05和P0.01),顯示出治療SCZ陰性癥狀的良好效果。這些結(jié)果也表明MiceProfiler可以精確、客觀的提取和分析實(shí)驗(yàn)動物多重模式的社會交往行為,并能檢測分析SCZ模型鼠的社會交往缺陷。隨后我們記錄并分析了SCZ發(fā)育模型鼠成年后的的社會交往行為變化,先記錄了4min,觀察藥物對于模型鼠的影響,隨后又記錄了4min,觀察動物行為隨時間的變化。首先分析了接觸次數(shù)和接觸時間,在0-4min和4-8min的兩個時間段內(nèi),MK-801模型鼠的接觸次數(shù)(21.40±5.22次和33.6+8.52次)均較對照組明顯減少(58.80+7.46次和71.60±8.98次),并且具有明顯的差異(P0.001和P0.01)；帕潘立酮治療組明顯的增加接觸次數(shù)(38.23±5.23次和57.23±9.23次,均P0.05)。但在0-4和4-8min內(nèi)接觸時間統(tǒng)計(jì)無差異。近距離位置事件結(jié)果也顯示,0-4min內(nèi)MK-801處理組近距離位置事件發(fā)生次數(shù)和時程明顯低于對照組(P0.01和P0.05),而帕潘立酮只能增加近距離位置時間發(fā)生的時程(P0.01)；4-8min內(nèi),MK-801處理組中只有發(fā)生次數(shù)降低了(P0.01),帕潘立酮可以逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象(P0.01)。這些結(jié)果暗示MK-801顯著誘導(dǎo)SCZ孤僻的陰性癥狀,模型鼠經(jīng)MK-801處理導(dǎo)致接觸次數(shù)和近距離位置事件發(fā)生的次數(shù)減少了,并且近距離位置事件時程部分減少。帕潘立酮可以部分增加近距離位置事件。隨后,我們分析了模型鼠逃避行為,結(jié)果顯示,在0-4min和4-8min的兩個時間段內(nèi),MK-801模型鼠的逃避行為次數(shù)和逃避時間(11.6±0.98次和34.12±3.12s)比對照組顯著增加(4.2±.15次和9.1±0.42s),并具有顯著差異(P0.01和P0.001)。給予帕潘立酮處理后,0-4min逃避次數(shù)和時間明顯低于MK-801處理組(均P0.05)。4-8min也記錄到了相同的結(jié)果,MK-801處理組的逃避次數(shù)和時間明顯高于對照組,而帕潘立酮治療可以減弱這種趨勢。表明帕潘立酮可改善SCZ模型鼠的逃避行為。最后,應(yīng)用Miceprofiler軟件分析了停止行為,即動物交往中位置不變的行為。結(jié)果顯示,MK-801模型鼠的停止行為次數(shù)明顯少于對照組,從視頻錄像分析顯示,動物的刻板行為增多,包括搖動前爪和相互理毛等,說明MK-801也可誘導(dǎo)出SCZ陽性癥狀。Miceprofiler可通過停止行為的檢測反應(yīng)部分模型鼠的陽性癥狀,但帕潘立酮沒能改善停止行為的變化。本部分結(jié)果顯示,MK-801損傷幼鼠成年后表現(xiàn)出明顯的社會交往缺陷,接觸次數(shù)及時間減少,近距離位置事件減少,逃避行為增加,模擬了SCZ情感淡漠、社會退縮的陰性癥狀。新一代抗精神病藥物帕潘立酮可部分改善SCZ神經(jīng)發(fā)育模型鼠成年后的陰性癥狀。同時,Miceprofile軟件可客觀、準(zhǔn)確提取并分析SCZ發(fā)育模型鼠多重模式的社會交往行為缺陷變化。結(jié)論揭示精神分裂癥的致病機(jī)制并尋找有效治療方法一直是精神病學(xué)的研究熱點(diǎn)。在幼鼠腦發(fā)育期阻斷NMDA受體對皮層神經(jīng)元活性、興奮性及成年后社會交往行為的影響和相關(guān)機(jī)制尚不清楚。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn),首先,從細(xì)胞水平上,通過MK-801毀損原代腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞模型并給予帕潘立酮進(jìn)行保護(hù)處理發(fā)現(xiàn),帕潘立酮可通過上調(diào)SIRT1、降低miR-134表達(dá)對抗MK-801導(dǎo)致的神經(jīng)損傷,提高神經(jīng)元活性,并通過激活內(nèi)向Ih電流增加神經(jīng)元興奮性。其次,從動物水平上,建立了MK-801損傷幼鼠SCZ發(fā)育動物模型,發(fā)現(xiàn)MK-801可減少額葉皮層神經(jīng)元自發(fā)動作電位、誘發(fā)動作電位的幅度,抑制神經(jīng)興奮性,帕潘立酮可明顯增加自發(fā)及誘發(fā)電位幅度,提高神經(jīng)興奮性。通過新生鼠腦內(nèi)基因電轉(zhuǎn)導(dǎo)入shRNA干擾載體,分別沉默SIRT1和miR-134基因表達(dá),可靠地證明了SIRT1/miR-134分子通路參與了MK-801導(dǎo)致的神經(jīng)興奮性及突觸功能損傷。最后,從行為學(xué)分析上,我們使用基于視頻的社會交往行為分析軟件MiceProfiler分析了MK-801損傷幼鼠成年后的社會交往缺陷表現(xiàn),并發(fā)現(xiàn)帕潘立酮可有效改善MK-801誘導(dǎo)的社會交往缺陷。綜上,本研究課題初步探討了NMDA受體阻斷劑MK-801導(dǎo)致幼鼠腦皮層神經(jīng)元損傷及可能的分子機(jī)制,檢測了幼鼠成年后社會交往缺陷行為變化,并分析了帕潘立酮的治療作用,為揭示精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制及有效治療提供了一個新的思路。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R749.3
【目錄】：

• 中文摘要8-17
• ABSTRACT17-27
• 前言27-32
• 符號說明32-34
• 第一部分：NK-801誘導(dǎo)培養(yǎng)腦皮層神經(jīng)元損傷的分子機(jī)制及帕潘立酮的神經(jīng)保護(hù)作用34-62
• 材料和方法34-48
• 結(jié)果48-52
• 討論52-54
• 結(jié)論54-55
• 附圖55-62
• 第二部分：帕潘立酮對MK-801導(dǎo)致幼鼠額葉皮層神經(jīng)元興奮性降低的干預(yù)機(jī)制分析62-92
• 材料和方法62-73
• 結(jié)果73-78
• 討論78-81
• 結(jié)論81-82
• 附圖82-92
• 第三部分：MK-801損傷幼鼠成年后社會交往缺陷行為分析及帕潘立酮的治療作用92-109
• 材料和方法92-95
• 結(jié)果95-99
• 討論99-101
• 結(jié)論101-103
• 附圖103-109
• 參考文獻(xiàn)109-117
• 致謝117-118
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄118-119
• 學(xué)位評閱及答辯情況表119-120
• 英文論文1120-141
• 英文論文2141-161

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本文編號：582361