本文關(guān)鍵詞：可穿膜重組TAT-tCNTF的透膜機(jī)制及對(duì)Aβ?lián)p傷小鼠的作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： TAT-tCNTF 阿爾茨海默病 β淀粉樣蛋白 血腦屏障 海馬神經(jīng)元

【摘要】：阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病，隨著人口老齡化的加劇，AD的患病人數(shù)在不斷增加，這就給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。然而目前用以治療AD的藥物，比如抗膽堿酯酶藥物，只能緩解某些癥狀，不能從根本上修復(fù)神經(jīng)元和阻止疾病的發(fā)展。因此開發(fā)能夠阻止病程發(fā)展、延緩AD發(fā)生的有效治療藥物極為必要。β淀粉樣蛋白（β-amyliod protein，Aβ）沉積形成的淀粉樣斑塊和tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）是AD的兩大主要病理特征，同時(shí)Aβ引起的淀粉樣沉積也是AD發(fā)生的始動(dòng)因素，并導(dǎo)致AD患者的神經(jīng)元退化。 前期研究以及國內(nèi)外文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員，不僅能夠促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)，維持細(xì)胞的存活，而且能夠顯著減少Aβ的聚集和沉積，這也是AD患者所需治療的主要方面。故CNTF具有治療AD的良好前景。但CNTF是蛋白質(zhì)大分子，很難透過血腦屏障（blood-brainbarrier，BBB）到達(dá)靶部位與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，這就限制了CNTF的臨床應(yīng)用。人類免疫缺陷病毒HIV-1的反式激活蛋白（Trans-activator transcription，TAT）是一種有效的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（protein transduction domain，PTD），它能攜帶外源性大分子并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，這就為分子量較大且難跨膜的藥物提供了良好的改造手段。本課題將TAT和截短式的（truncated）CNTF基因經(jīng)過重組并在大腸桿菌中表達(dá)，再經(jīng)分離純化獲得TAT-tCNTF融合蛋白。隨后考察了TAT-tCNTF的透膜特性和透膜機(jī)制，以及融合蛋白對(duì)Aβ?lián)p傷細(xì)胞和Aβ?lián)p傷小鼠模型的作用和作用機(jī)制。 采用雙室雙層細(xì)胞在體外建立血腦屏障細(xì)胞模型，通過檢測(cè)雙室模型下層中CF488A標(biāo)記的TAT-tCNTF的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)TAT-tCNTF能夠跨過BBB細(xì)胞模型，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)跨過BBB細(xì)胞模型的蛋白增加。在體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞中，TAT-tCNTF能夠順利跨過細(xì)胞膜而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，而rhCNTF卻較難通過生物膜，基本不能在細(xì)胞內(nèi)觀察到其熒光標(biāo)記的熒光信號(hào)。由于TAT-tCNTF的跨膜性能可能與TAT相似，而TAT主要通過內(nèi)吞作用跨過生物膜，故用內(nèi)吞抑制劑對(duì)TAT-tCNTF的跨膜效應(yīng)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)巨胞飲抑制劑細(xì)胞松弛素D（cytochalasin D，CD）和鹽酸阿米洛利（amiloride hydrochloride，AMI）能夠抑制TAT-tCNTF進(jìn)入細(xì)胞，明確了TAT-tCNTF主要是通過巨胞飲方式進(jìn)入細(xì)胞。然而CD并未完全阻止TAT-tCNTF跨膜，該作用可能與CD影響細(xì)胞內(nèi)F-actin結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量有關(guān)。在小鼠體內(nèi)，腹腔注射TAT-tCNTF后取材，對(duì)海馬組織切片進(jìn)行TAT的免疫熒光實(shí)驗(yàn)，觀察到TAT-tCNTF在海馬區(qū)有分布，證明TAT-tCNTF能夠穿過血腦屏障進(jìn)入大腦。 在體外，TAT-tCNTF跨過生物膜后能夠緩解Aβ引起的細(xì)胞內(nèi)損傷，提高受Aβ?lián)p傷細(xì)胞的活力并降低Aβ引起的早期凋亡。本課題在體外細(xì)胞中也研究了TAT-tCNTF對(duì)損傷細(xì)胞的作用。利用體外分離培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元，Aβ處理后其細(xì)胞活力降低、早期凋亡增加，而經(jīng)TAT-tCNTF處理后，海馬神經(jīng)元的細(xì)胞活力增加、早期凋亡減少。在體內(nèi)側(cè)腦室注射Aβ能夠明顯引起小鼠腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積，而Aβ?lián)p傷后的小鼠經(jīng)腹腔注射TAT-tCNTF，進(jìn)入小鼠大腦的TAT-tCNTF能夠明顯減少海馬部位Aβ所致的淀粉樣沉積。 TAT-tCNTF對(duì)Aβ?lián)p傷小鼠模型的治療作用不僅體現(xiàn)在組織病理學(xué)上，還表現(xiàn)在小鼠的行為學(xué)上。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，Aβ處理的小鼠較對(duì)照組的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)而平均游泳速度明顯減慢；同時(shí)在被動(dòng)逃避的穿梭箱實(shí)驗(yàn)中，Aβ處理的小鼠較對(duì)照組首次電擊時(shí)間短而限定時(shí)間內(nèi)遭受電擊的次數(shù)多，這些都反映出Aβ導(dǎo)致了小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的減退。TAT-tCNTF治療后的Aβ?lián)p傷小鼠在以上方面均有所改善。對(duì)Aβ?lián)p傷小鼠的腦組織進(jìn)行取材切片，并對(duì)海馬部位進(jìn)行Ki67免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)Aβ能夠減少小鼠海馬部位的DG區(qū)、CA1區(qū)和CA3區(qū)的Ki67+細(xì)胞數(shù)，western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Aβ?lián)p傷小鼠的海馬區(qū)cyclinD1蛋白表達(dá)量也明顯下降，證明Aβ能夠抑制小鼠海馬區(qū)的細(xì)胞增殖；而經(jīng)TAT-tCNTF治療的小鼠Ki67+細(xì)胞數(shù)和cyclinD1蛋白表達(dá)量較多，說明TAT-tCNTF能夠改善Aβ對(duì)小鼠海馬細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。除此之外，NeuN與Ki67的免疫組化實(shí)驗(yàn)證明NeuN+的神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)也受到Aβ的抑制，同樣TAT-tCNTF能夠拮抗Aβ的這種作用。BrdU滯留實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Aβ?lián)p傷小鼠的海馬DG區(qū)、CA1區(qū)和CA3區(qū)的BrdU+細(xì)胞數(shù)均明顯增多，同樣證明細(xì)胞增殖減慢，與Ki67的免疫組織化學(xué)檢測(cè)以及cyclinD1蛋白表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果一致；BrdU+GFAP免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)顯示Aβ?lián)p傷小鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生，而經(jīng)TAT-tCNTF治療的模型小鼠腦內(nèi)幾乎檢測(cè)不到BrdU+細(xì)胞，同時(shí)GFAP+細(xì)胞數(shù)也明顯減少，說明TAT-tCNTF能夠促進(jìn)小鼠腦內(nèi)細(xì)胞增殖并緩解Aβ誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞增生。Western blot檢測(cè)Aβ前體蛋白（Aβ precursor protein，APP）和tau蛋白及磷酸化tau蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)TAT-tCNTF幾乎不影響APP的蛋白表達(dá)量，卻明顯減少Aβ所致的小鼠腦內(nèi)tau蛋白過度磷酸化；說明TAT-tCNTF緩解Aβ?lián)p傷小鼠的病理特征并不是影響了Aβ的上游通路，而是通過降低磷酸化tau蛋白的水平，進(jìn)而降低了神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）的水平。 由于TAT-tCNTF的生物學(xué)效應(yīng)主要來自CNTF，故TAT-tCNTF需要與CNTF受體CNTFRα結(jié)合，然后激活CNTF的下游通路而發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)考察了CNTF下游通路中Akt、Erk和Stat3分子及其磷酸化形式的蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的第26天和第45天小鼠的DG區(qū)、Cx區(qū)、SVZ區(qū)和海馬部位的其他區(qū)域，TAT-tCNTF能夠明顯上調(diào)磷酸化Erk的水平，而對(duì)于p-Akt/Akt水平僅在第26天的小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)明顯改變，然而Stat3的磷酸化并未增多，證明TAT-tCNTF能夠激活Erk和Akt通路而未能激活Stat3通路�？傊琓AT-tCNTF通過與CNTFRα結(jié)合激活Erk和Akt通路，進(jìn)而明顯改善Aβ?lián)p傷小鼠的病理和表型。 本課題將難以透膜的CNTF經(jīng)基因重組構(gòu)建表達(dá)出可穿膜的TAT-tCNTF融合蛋白，，經(jīng)驗(yàn)證TAT-tCNTF能穿過生物膜和血腦屏障。同時(shí)顯示TAT-tCNTF對(duì)Aβ?lián)p傷細(xì)胞和小鼠均有較好的治療效果，并且闡明了TAT-tCNTF主要以巨胞飲方式跨膜，在體內(nèi)通過BBB進(jìn)入小鼠腦內(nèi)，然后與CNTFRα結(jié)合，并通過激活Erk和Akt通路進(jìn)而達(dá)到改善Aβ?lián)p傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，促進(jìn)小鼠腦內(nèi)海馬部位的細(xì)胞生長(zhǎng)、神經(jīng)元存活并緩解神經(jīng)膠質(zhì)化。本課題解決了CNTF不能在臨床應(yīng)用的難題，為TAT-tCNTF的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)，同時(shí)為AD的治療提供了良好前景。
【關(guān)鍵詞】：TAT-tCNTF 阿爾茨海默病 β淀粉樣蛋白 血腦屏障 海馬神經(jīng)元
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 縮略詞表8-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-15
• 前言15-17
• 第一章 TAT-tCNTF 透膜機(jī)制的研究17-37
• 一、 實(shí)驗(yàn)材料17-19
• 1、 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞17
• 2、 主要儀器17-18
• 3、 主要試劑和主要溶液18-19
• 二、 實(shí)驗(yàn)方法19-24
• 1、 細(xì)胞培養(yǎng)19-20
• 2、 體外 BBB 細(xì)胞模型的建立20
• 3、 跨內(nèi)膜電阻值（TEER）的測(cè)定20
• 4、 HRP 通透性檢測(cè)20-21
• 5、 羅丹明-鬼筆環(huán)肽直接熒光染色 F-actin21
• 6、 Real-time PCR 檢測(cè) zo-1、claudin-5 和 occludin 的 mRNA 表達(dá)量21
• 7、 TAT-tCNTF 在體外 BBB 模型中的通透性21-22
• 8、 內(nèi)吞抑制劑對(duì) TAT-tCNTF 透膜性的影響22
• 9、 細(xì)胞松弛素 D 對(duì) TAT-tCNTF 作用于細(xì)胞 F-actin 的影響22-23
• 10、 CD 對(duì) TAT-tCNTF 引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)定的影響23
• 11、CD 對(duì)細(xì)胞 F-actin 的作用23-24
• 12、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理24
• 三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-34
• 1、 BBB 細(xì)胞模型的建立24-25
• 2、 BBB 細(xì)胞模型的 TEER 值隨著時(shí)間的變化25-26
• 3、 不同 BBB 細(xì)胞模型的 HRP 通透量不同26-27
• 4、 羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色 F-actin 的分布不同27-28
• 5、 四種 BBB 細(xì)胞模型中 TJs 的 mRNA 表達(dá)水平不同28-30
• 6、 TAT-tCNTF 通過體外 BBB 細(xì)胞模型的量隨著時(shí)間增多30-31
• 7、 內(nèi)吞抑制劑抑制 CF488A-TAT-tCNTF 的透膜31-32
• 8、 TAT-tCNTF 在 CD 環(huán)境下對(duì)細(xì)胞 F-actin 的維持作用減弱32-33
• 9、 CD 引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度升高33-34
• 10、 CD 對(duì)細(xì)胞 F-actin 表達(dá)無明顯影響34
• 四、 討論34-37
• 第二章 TAT-tCNTF 對(duì) Aβ?lián)p傷作用的影響37-47
• 一、 實(shí)驗(yàn)材料37-39
• 1、 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞37
• 2、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物37
• 3、 主要儀器37
• 4、 主要試劑37-39
• 二、 實(shí)驗(yàn)方法39-42
• 1、 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)39
• 2、 NSE 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定海馬神經(jīng)元39-40
• 3、 TAT-tCNTF 對(duì) Aβ?lián)p傷海馬神經(jīng)元的細(xì)胞活動(dòng)度的影響40
• 4、 TAT-tCNTF 對(duì) Aβ海馬神經(jīng)元的早期凋亡的影響40
• 5、 TAT-tCNTF 對(duì) Aβ?lián)p傷小鼠的海馬區(qū)的影響40-42
• 6、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理42
• 三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-45
• 1、 成功分離并培養(yǎng)了原代海馬神經(jīng)元42
• 2、 海馬神經(jīng)元的鑒定42-43
• 3、 TAT-tCNTF 促進(jìn) Aβ?lián)p傷的海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)43
• 4、 TAT-tCNTF 抑制 Aβ引起的海馬神經(jīng)元的早期凋亡43-44
• 5、 TAT-tCNTF 減少 Aβ?lián)p傷小鼠海馬區(qū)的淀粉樣沉積44-45
• 四、 討論45-47
• 第三章 TAT-tCNTF 對(duì) Aβ?lián)p傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶影響47-65
• 一、 實(shí)驗(yàn)材料47-48
• 1、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物47
• 2、 主要儀器47
• 3、 主要試劑47-48
• 二、 實(shí)驗(yàn)方法48-51
• 1、 小鼠腹腔注射 BrdU48
• 2、 Morris 水迷宮檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力48-49
• 3、 被動(dòng)逃避實(shí)驗(yàn)（穿梭箱實(shí)驗(yàn)）檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力49
• 4、 Ki67 免疫組化鑒定小鼠海馬區(qū)細(xì)胞增殖情況49
• 5、 NeuN 免疫組化鑒定小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元存活能力49
• 6、 GFAP+BrdU 雙標(biāo)觀察小鼠海馬區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞49-50
• 7、 Western blot 半定量觀察小鼠海馬區(qū)蛋白表達(dá)量50-51
• 8、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理51
• 三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-63
• 1、 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)示意圖51
• 2、 Aβ引起小鼠海馬區(qū)的細(xì)胞增殖減少51-52
• 3、 TAT-tCNTF 改善 Aβ?lián)p傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力52-54
• 4、 TAT-tCNTF 促進(jìn) Aβ?lián)p傷小鼠海馬區(qū)的神經(jīng)元存活54-56
• 5、 TAT-tCNTF 能夠減少 Aβ誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞增生56-57
• 6、 TAT-tCNTF 減少 Aβ小鼠海馬區(qū)神經(jīng)原纖維纏結(jié)57-59
• 7、 TAT-tCNTF 通過激活 CNTF 通路從而緩解 Aβ小鼠的損傷59-63
• 四、 討論63-65
• 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 附錄70-72
• 綜述72-78
• 參考文獻(xiàn)75-78
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷78-79
• 致謝79

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Hao Fan;YuGuo;Xiaoyan Liang;Yibiao Yuan;Xiaohong Qi;Min Wang;Jianhua Ma;Hong Zhou;;Hydrogen sulfide protects against amyloid beta-peptide induced neuronal injury via attenuating inflammatory responses in a rat model[J];The Journal of Biomedical Research;2013年04期

2 吳行偉;張琴;唐希;吳坤;任文靜;趙振滿;陳曉倩;金欣;王德花;劉澤源;曲恒燕;;TAT-tCNTF提高Aβ?lián)p傷細(xì)胞模型的GSH水平和SOD酶活性研究[J];中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè);2012年05期

本文編號(hào)：549020