本文關(guān)鍵詞：川芎嗪烴基哌嗪衍生物CXC137對NMDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷及血管性癡呆模型大鼠保護(hù)作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】： 血管性癡呆是發(fā)生在腦血管基礎(chǔ)上的以記憶、認(rèn)知功能缺損為主,或伴有語言、視空間技能及情感或人格障礙的獲得性智能持續(xù)性損害的綜合征。血管性癡呆產(chǎn)生原因多為腦梗塞導(dǎo)致腦缺血-再灌注引起的腦實(shí)質(zhì)損傷。當(dāng)今研究表明：興奮性氨基酸毒性、自由基損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡是缺血-再灌注導(dǎo)致的腦實(shí)質(zhì)損傷進(jìn)而引起血管性癡呆的主要分子生物學(xué)機(jī)制。 川芎嗪是中藥川芎的主要有效成分之一,具有清除氧自由基、鈣拮抗、擴(kuò)血管、抗血小板聚集和血栓形成等多種作用,廣泛應(yīng)用于臨床治療。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化,生成極性和水溶性較大的代謝物而迅速被排出體外,所以川芎嗪存在半衰期短,生物利用度低等缺點(diǎn)。本課題選用的化合物CXC137,是以氟桂利嗪的主要藥效基團(tuán)二苯甲基-1-哌嗪基甲基基團(tuán)取代川芎嗪的藥代基團(tuán)2位甲基而合成出的新型川芎嗪烴基哌嗪類衍生物。氟桂利嗪為第2代哌嗪類鈣拮抗藥,能通過血腦屏障,選擇性擴(kuò)張血管,預(yù)防缺血、缺氧引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載所致細(xì)胞損害,臨床上廣泛用于心腦血管疾病和外周血管功能不全的防治。以氟桂利嗪的活性基團(tuán)取代川芎嗪分子的藥代基團(tuán),以期克服川芎嗪體內(nèi)半衰期短、生物利用度低等缺點(diǎn),并通過協(xié)同作用增強(qiáng)藥效,提高抗心腦血管疾病作用。 本研究第一部分以N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)作用于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y),模擬體內(nèi)興奮性氨基酸毒性造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷,第二部分采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎并降壓的方法制作大鼠血管性癡呆模型。實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑閺牟煌矫嫣接慍XC137對NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷和抗凋亡的作用機(jī)制,以及對血管性癡呆模型大鼠的藥理學(xué)作用,為進(jìn)一步開發(fā)該化合物治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理論基礎(chǔ)。同時(shí),以傳統(tǒng)中藥的有效成分為先導(dǎo)化合物,在構(gòu)效關(guān)系研究的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化,為充分利用我國豐富的天然植物資源進(jìn)行創(chuàng)新藥物研究提供依據(jù)。 1.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響 采用MTT法檢測細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：SH-SYSY細(xì)胞經(jīng)NMDA200μmol／L損傷后,細(xì)胞活力明顯降低(P0.01)。而溶媒組(3%oDMSO)對細(xì)胞活力無影響。同時(shí)發(fā)現(xiàn),NMDA損傷前或損傷后給予CXC137均對細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用(P0.01)。 2.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放率的影響 收集氧化損傷處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液,參照試劑盒說明分別測定培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中的LDH活性,計(jì)算細(xì)胞LDH釋放率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NMDA損傷后SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放率顯著增高(P0.01)。與模型組相比,CXC137處理后可明顯降低細(xì)胞LDH釋放率(P0.01)。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞經(jīng)處理后,以Annexin V-FITC／PI雙染后上流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與正常組比較,模型組細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P0.01)。與模型組比較,CXC137各濃度組細(xì)胞的凋亡率明顯降低,且呈劑量依賴性關(guān)系,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 4.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白活性及表達(dá)的影響 使用Caspase-3活力檢測試劑盒和Western Blot檢測Caspase-3活力和表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：加入NMDA后,Caspase-3蛋白活性及表達(dá)均明顯升高(P0.01),CXC13720、40和80μmol／L三個(gè)劑量組均可顯著降低Caspase-3活力和蛋白表達(dá)水平(P0.05或P0.01)。 5.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響 細(xì)胞懸液以熒光探針Fura-3／AM負(fù)載后,置多功能酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度,檢測波長為λem=490 nm/λex=526nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：加入NMDA損傷后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高(P0.01)。給予20、40、80μmol／L CXC137后,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均顯著降低(P0.01)。 6.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞ATP含量的影響 收集細(xì)胞裂解液,用考馬斯亮藍(lán)法定細(xì)胞內(nèi)總蛋白量。按ATP含量檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞ATP含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：加入NMDA后,細(xì)胞內(nèi)ATP含量明顯降低(P0.01)。給予20、40、80μmol／L CXC137后,ATP含量顯著升高(P0.01)。 7.DPPH*法測定CXC137體外清除自由基能力 將不同濃度的抗氧化劑加入DPPH*后,在516nm處的紫外吸光度會(huì)發(fā)生改變,用以檢測化合物清除自由基的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：50mg／ml CXC137體外自由基清除率在40%左右,具有一定的清除自由基的能力。但清除能力不如維生素E和TMP。 8.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞MDA、GSH含量,SOD活力的影響 收集細(xì)胞裂解液,用考馬斯亮藍(lán)法定細(xì)胞內(nèi)總蛋白量,按MDA、GSH、SOD檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH含量、SOD活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：加入NMDA后,細(xì)胞內(nèi)MDA生成量顯著增高(P0.01)。與NMDA組相比,40、80μmol／L CXC137組細(xì)胞內(nèi)MDA生成量均明顯減少(P0.01)。加入NMDA后,細(xì)胞內(nèi)SOD活力和GSH含量均顯著降低(P0.01)。與NMDA組相比,40、80μmol／L CXC137組細(xì)胞SOD活力和GSH含量均明顯升高(P0.01)。 9.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)NO含量和NOS活性的影響 收集細(xì)胞裂解液,用考馬斯亮藍(lán)法定細(xì)胞內(nèi)總蛋白量,按NO、NOS檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞內(nèi)NO含量和NOS活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：SH-SY5Y細(xì)胞的NO含量,在NMDA損傷后開始升高,在加入NMDA后24h達(dá)到最高峰,隨后含量開始下降,加入80μmol／L CXC137和氟桂利嗪后,SH-SY5Y細(xì)胞的NO含量均有所下降。SH-SY5Y細(xì)胞的tNOS和iNOS的含量,在NMDA損傷后開始升高,在加入NMDA后12h達(dá)到最高峰,隨后含量開始下降,在36-48h時(shí)降至正常水平；加入80μmol／L CXC137和氟桂利嗪后,SH-SY5Y細(xì)胞的tNOS和iNOS含量均有所下降。 10.CXC137對血管性癡呆模型大鼠行動(dòng)能力的影響 前肢抓握實(shí)驗(yàn)是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的檢查動(dòng)物行動(dòng)能力的實(shí)驗(yàn)方法,方法簡便、快捷。手術(shù)后第30日經(jīng)行前肢抓握實(shí)驗(yàn)用以檢測實(shí)驗(yàn)大鼠行動(dòng)能力,并進(jìn)行評分結(jié)果表明：反復(fù)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后,動(dòng)物的行動(dòng)能力有所降低,給予CXC137治療后,動(dòng)物行動(dòng)能力有所提高。 11.CXC137對血管性癡呆模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響 本實(shí)驗(yàn)采用Morris水迷宮檢測大鼠的空間記憶能力,包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩項(xiàng)檢測指標(biāo)。在定位航行實(shí)驗(yàn)中,模型組大鼠測試成績最差,逃避潛伏期比假手術(shù)組明顯延長(p0.01)；另外空間探索實(shí)驗(yàn)中,穿越平臺(tái)次數(shù)和在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間均顯著減少(p0.01),表明雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎造成大鼠腦慢性缺血,4周后模型大鼠已出現(xiàn)顯著的學(xué)習(xí)記憶能力損害,而給予80mg／kgCXC137后,大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期有所降低,空間探索實(shí)驗(yàn)中,穿越平臺(tái)次數(shù)和在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間均顯著增高(p0.01)。 12.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)谷氨酸含量的影響 收集實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織勻漿,用考馬斯亮藍(lán)法定細(xì)胞內(nèi)總蛋白量,按谷氨酸含量檢測試劑盒說明書測定組織谷氨酸含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)結(jié)扎并降壓后,大鼠腦組織勻漿中谷氨酸含量明顯升高(P0.01)。與模型組相比,20、80mg／kg CXC137能夠降低腦組織中谷氨酸含量(p0.05)。 13.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)MDA、GSH含量和SOD活性的影響 收集實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織勻漿,用考馬斯亮藍(lán)法定細(xì)胞內(nèi)總蛋白量,按MDA、GSH含量檢測試劑盒說明書測定組織MDA、GSH含量,按SOD活性檢測試劑盒說明書測定組織SOD活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)結(jié)扎并降壓后,大鼠腦組織勻漿中MDA含量明顯升高(P0.01)；SOD活性和GSH含量明顯降低(P0.01)。與模型組相比,20、80mg／kg CXC137能夠降低腦組織中MDA含量(P0.01),80mg／kgCXC137能夠升高組織SOD活性和GSH含量(P0.01)。 14.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)NO含量及NOS活性的影響 收集實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織勻漿,用考馬斯亮藍(lán)法定細(xì)胞內(nèi)總蛋白量,按NO含量檢測試劑盒說明書測定組織NO含量,按NOS活性檢測試劑盒說明書測定組織NOS活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)結(jié)扎并降壓4周后,大鼠腦組織勻漿中NO含量和NOS活性無顯著變化(無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。 15.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)線粒體的影響 線粒體懸液的渾濁度可反映線粒體腫脹度,其吸光度越高說明線粒體腫脹程度越高,線粒體損傷越嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)結(jié)扎并降壓4周后,大鼠腦內(nèi)線粒體腫脹度明顯升高(P0.01),說明雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)結(jié)扎并降壓能損傷大鼠腦線粒體；給予20,40mg／kgCXC137后,大鼠腦線粒體腫脹度顯著降低(P0.05)。
【關(guān)鍵詞】：川芎嗪烴基哌嗪衍生物 NMDA 血管性癡呆 細(xì)胞凋亡 SH-SY5Y細(xì)胞株
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R749.13
【目錄】：

• 目錄4-10
• 中文摘要10-15
• Abstract15-20
• 符號說明20-22
• 第一部分 CXC137對NMDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響22-57
• 前言22-25
• 實(shí)驗(yàn)材料25-28
• 實(shí)驗(yàn)方法28-33
• 1.細(xì)胞培養(yǎng)28
• 2.實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目及檢測指標(biāo)28-32
• 2.1 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞存活力的影響28-29
• 2.1.1 MTT法檢測細(xì)胞存活力28-29
• 2.1.2 LDH釋放率測定29
• 2.2 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響29-30
• 2.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率29-30
• 2.2.2 Caspase-3試劑盒檢測Caspase-3活力30
• 2.2.3 Western Blot檢測CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)的影響30
• 2.3 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響30-31
• 2.4 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響31
• 2.5 CXC137對自由基的影響31-32
• 2.5.1 DPPH~*法測定CXC137體外清除自由基能力31-32
• 2.5.2 酶生化法測定細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH含量、SOD活力32
• 2.6 細(xì)胞內(nèi)NO含量和NOS活性的測定32
• 3.數(shù)據(jù)處理32-33
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-49
• 1.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響33-36
• 1.1 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞存活力的影響33-34
• 1.2 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放率的影響34-36
• 2.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響36-40
• 2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率36-38
• 2.2 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白活性及表達(dá)的影響38-40
• 3.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響40-41
• 4.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響41-42
• 5.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)自由基的影響42-46
• 5.1 DPPH~*法測定CXC137體外清除自由基能力42-43
• 5.2 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH含量,SOD活力的影響43-46
• 5.2.1 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞MDA含量的影響43-44
• 5.2.2 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)SOD活性的影響44
• 5.2.3 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響44-46
• 6. CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)NO含量和NOS活性的影響46-49
• 討論49-57
• 第二部分 CXC137對血管性癡呆模型大鼠的保護(hù)作用研究57-73
• 前言57
• 實(shí)驗(yàn)材料57-59
• 實(shí)驗(yàn)方法59-61
• 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組59
• 2.大鼠血管性癡呆模型制備及給藥59
• 3.前肢抓握實(shí)驗(yàn)59
• 4.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)59-60
• 5.生化指標(biāo)檢測60-61
• 5.1 標(biāo)本采集60
• 5.2 谷氨酸、MDA、GSH、NO含量,SOD、NOS活性測定60-61
• 5.3 線粒體提取及線粒體腫脹度61
• 5.3.1 線粒體提取61
• 5.3.2 線粒體腫脹度檢測61
• 6.數(shù)據(jù)處理61
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-69
• 1.CXC137對血管性癡呆模型大鼠行動(dòng)能力的影響61-62
• 2.CXC137對血管性癡呆模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響62-64
• 3.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)谷氨酸含量的影響64-65
• 4.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)MDA、GSH含量和SOD活性的影響65-67
• 5.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)NO含量及NOS活性的影響67-68
• 6.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)線粒體的影響68-69
• 討論69-73
• 結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-79
• 致謝79-80
• 攻讀碩士學(xué)位論文期間發(fā)表的論文80-81
• 發(fā)表論文81-98
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表98

【引證文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張偉;超聲強(qiáng)化超臨界CO_2提取復(fù)方川芎丹參及其提取物藥效研究[D];華南理工大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：川芎嗪烴基哌嗪衍生物CXC137對NMDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷及血管性癡呆模型大鼠保護(hù)作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：348066