帕金森病（Parkinson’s disease,PD）現(xiàn)今已經(jīng)成為僅次于阿爾茲海默癥的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。PD的運(yùn)動(dòng)癥狀（運(yùn)動(dòng)遲緩、震顫、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)異常）為人們所熟知,但其非運(yùn)動(dòng)癥狀常常被忽視;認(rèn)知障礙是最常見(jiàn)且具有致殘性的非運(yùn)動(dòng)癥狀,其中包括PD輕度認(rèn)知障礙（PD mild cognitive impairment,PD-MCI）和PD癡呆（PD dementia,PDD）,MCI是PD晚期發(fā)生癡呆的預(yù)警信號(hào)之一。研究顯示,當(dāng)診斷為PD時(shí),將近30%患者已患有MCI;超過(guò)40%認(rèn)知功能正常的PD患者將在6年內(nèi)發(fā)展為MCI,而到了PD晚期,將近80%的患者可出現(xiàn)PDD。PDD嚴(yán)重?fù)p害患者的身心健康,顯著降低其生活質(zhì)量,給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。因此,若能及時(shí)檢測(cè)和早發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行干預(yù),有利于阻止晚年癡呆的發(fā)展。但目前并無(wú)早期診斷PD認(rèn)知障礙的生物標(biāo)志物,其癥狀性治療獲益有限,也尚無(wú)充分證據(jù)表明任何一種藥物有確切的疾病修飾療效、從而延遲PD患者的認(rèn)知下降。葡萄糖腦苷酯酶（Glucocerebrosidase,GBA）功能喪失突變與PD的嚴(yán)重認(rèn)知障礙相關(guān),GBA突變的PD患者認(rèn)... 

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GBA調(diào)控區(qū)的SNPrs12411216鑒定

第3章結(jié)果與討論27圖3-2PD患者GBA表達(dá)量與rs12411216基因型之間的關(guān)系3.4SNPrs12411216突變顯著影響GBA基因的表達(dá)因?yàn)镻D是神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，所以本實(shí)驗(yàn)中使用SH-SY5Y細(xì)胞（人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）。作為實(shí)驗(yàn)后續(xù)能否成功進(jìn)行的前提，細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)基因表達(dá)的情況是十分關(guān)鍵的。為了鑒定細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)基因表達(dá)，本研究先使用了RNA試劑盒提取了SY5Y細(xì)胞的RNA。再把提取出的RNA當(dāng)作模板,通過(guò)RT-PCR的方法來(lái)合成cDNA。之后設(shè)計(jì)PCR和瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，分別把SY5Y細(xì)胞的基因組和水設(shè)置為模板的陰性對(duì)照和空白對(duì)照。以SY5Y細(xì)胞基因組、水、cDNA進(jìn)行分別PCR，再將三者的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖3-3）。本研究的目的是鑒定SY5Y細(xì)胞中GBA基因的表達(dá)，所以在設(shè)計(jì)PCR和瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)時(shí)，本研究是以已知的GBA基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)的PCR引物，所以在PCR的過(guò)程中，只有和GBA相關(guān)的外顯子為底物才能生成PCR產(chǎn)物。因?yàn)榛蚪MDNA中既有內(nèi)含子也有外顯子，而cDNA是由RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，只含有外顯子。本研究PCR體系中有以SY5Y細(xì)胞RNA為模板反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA，若在cDNA的電泳道中有條帶存在，就可以證明有GBA基因的表達(dá)。本研究的凝膠電泳結(jié)果如圖3-4所示，cDNA的電泳道中有條帶存在，證明了SY5Y細(xì)胞中有GBA基因的表達(dá)。

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文28圖3-3GBA基因表達(dá)鑒定電泳圖圖注：第一列為DL2000Marker，第二列為水（空白對(duì)照），第三列為基因組（陰性對(duì)照），第四列為cDNA，第五列為β-actin（內(nèi)參）為了進(jìn)行靶序列的鑒定，本研究通過(guò)依據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中的GBA基因DHSs片段的基因序列，在DHS兩端剪切位點(diǎn)各延長(zhǎng)400bp設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步執(zhí)行純化操作，最后將純化的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。本研究就得到了如圖3-2的瓊脂糖凝膠電泳圖。本研究可以通過(guò)觀察靶序列擴(kuò)增純化電泳圖中目的條帶的外觀狀況來(lái)判斷本研究之前靶序列擴(kuò)增純化的結(jié)果是否良好。如圖3-5所示，目的泳道只有單一條帶，且該條帶與DL2000marker比對(duì)的大小（1451bp）也與本研究設(shè)計(jì)的結(jié)果相吻合。該條帶外外觀條件清晰明亮，說(shuō)明本研究的擴(kuò)增純化結(jié)果較為良好，可以進(jìn)一步將純化結(jié)果送至測(cè)序公司測(cè)序。本研究從測(cè)序公司獲得的測(cè)序結(jié)果如圖3-4所示。本研究再將本次的測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的GBA基因的基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)測(cè)序結(jié)果中僅有3個(gè)位點(diǎn)的數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列存在差異，并且這三個(gè)差異位點(diǎn)都為于本研究DHSs片段的兩端，不在本研究的敲除范圍內(nèi)，所以對(duì)本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響。由此可以證明本研究的目標(biāo)DHSs片段存在于SY5Y細(xì)胞的基因組中，且與數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列吻合，該SY5Y細(xì)胞可以用于本研究下一步的敲除實(shí)驗(yàn)。


本文編號(hào)：3231947