目的體外培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs),明確干擾Olig2對MK-801處理后海馬NSCs增殖、分化及凋亡的影響,探究Olig2對MK-801干預(yù)后海馬神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控作用。方法選取24h以內(nèi)的新生C57BL/6小鼠,分離提取海馬組織用來原代培養(yǎng)NSCs,采用免疫熒光染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定和純度鑒定。用200μM的MK-801處理NSCs 24h以建立細(xì)胞損傷模型,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Olig2-shRNA慢病毒感染,將NSCs分為4組:(1)MK-801+慢病毒干擾組[MK801+Olig2-shRNA組簡稱(M+O組)],(2)MK-801+慢病毒空載體組[MK-801+LV-EGFP簡稱(M+L組)],(3)MK-801組(簡稱M組),(4)空白對照組(簡稱Blank組)。采用Western blot檢測Olig2的表達(dá),以確定Olig2-shRNA慢病毒載體是否構(gòu)建成功。采用Western blot、Real-time PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測Nestin、Sox2、Ki67、S100β和NeuN的表達(dá),以觀察NSCs的增殖和分化情況,用流式細(xì)胞術(shù)檢測NSCs凋亡情況。結(jié)果Western blot結(jié)果顯示,Olig2-shRNA1組可明顯降低Olig2的表達(dá)(P0.05);與M組相比較,M+O組中Olig2表達(dá)明顯降低(P0.05),NeuN、Sox2顯著升高(P0.05),M+L組和Blank組中Olig2、NeuN、Sox2的表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,與M組相比較,M+O組中Nestin和Ki67表達(dá)顯著升高(P0.05),Blank組Nestin表達(dá)量顯著升高(P0.05),M+L組與M組相比Nestin表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),M+L組和Blank組分別與M組相比,Ki67的表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),M+O組、M+L組和Blank組S100β均無統(tǒng)計學(xué)差異;免疫熒光結(jié)果顯示,與M組相比,M+O組Ki67表達(dá)顯著升高(P0.05),M+L組和Blank組Ki67表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),M+O組、M+L組和Blank組S100β均無統(tǒng)計學(xué)差異;流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示,M+O組早期凋亡和總凋亡率較M組的凋亡率均降低且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),晚期凋亡對比無明顯差異;M組較Blank組早期凋亡和總凋亡率升高且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論1.經(jīng)MK-801處理NSCs后其增殖能力下降,凋亡增加。2.低表達(dá)Olig2可促進(jìn)精神分裂癥后NSCs的增殖、促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化,減少細(xì)胞凋亡,增加海馬神經(jīng)發(fā)生。
【學(xué)位單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R749.3
【部分圖文】：

1. 小鼠海馬 NSCs 培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng) 24 h 后，在條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下 NSCs 呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)，圓形，形態(tài)規(guī)則且折光性良好并且未見明顯聚球情況，可見部分顏色灰暗、折光性差的壞死細(xì)胞和細(xì)胞碎片會沉入培養(yǎng)瓶底，繼續(xù)培養(yǎng) 1-2 天，可見有少數(shù)細(xì)胞聚集成細(xì)胞團(tuán)狀，繼續(xù)培養(yǎng) 2-3 天可見細(xì)胞成桑葚狀聚集成球，這些克隆細(xì)胞球球體邊緣整齊，克隆球內(nèi)細(xì)胞未見突起排列緊密，折光性良好，并且隨培養(yǎng)時間增加而體積變大。培養(yǎng)至第 6-8 天時，克隆球中間顏色加深表示細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)進(jìn)行傳代處理。細(xì)胞傳代后，會繼續(xù)以單個懸浮細(xì)胞聚集成克隆球生長，傳代后，細(xì)胞貼壁狀態(tài)會減少，生長狀態(tài)一般會加快。選取第二代第 3 天使用免疫熒光標(biāo)記法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。Nestin 標(biāo)記海馬 NSCs，Nestin（red）和DAPI（blue）共表達(dá)。（圖 1）

圖 2 NSCs 克隆球消化為單細(xì)胞后的 Nestin 免疫熒光染色結(jié)果。A 表示 Nestin 標(biāo)記 NSCs，呈現(xiàn)紅色B 表示 DAPI 染細(xì)胞核，呈現(xiàn)藍(lán)色，C 表示 Nestin 與 DAPI 共標(biāo)記代表陽性細(xì)胞。Scale bar=50 μm3. Olig2 干擾慢病毒感染時間的確定對海馬 NSCs 分別進(jìn)行 24 h、48 h、72 h 慢病毒感染處理，結(jié)果顯示：細(xì)胞的熒光強(qiáng)度隨感染時間的增加而增強(qiáng)，72 h 熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)將海馬 NSC的感染時間確定為 72 h。（圖 3）

圖 2 NSCs 克隆球消化為單細(xì)胞后的 Nestin 免疫熒光染色結(jié)果。A 表示 Nestin 標(biāo)記 NSCs，呈現(xiàn)紅色B 表示 DAPI 染細(xì)胞核，呈現(xiàn)藍(lán)色，C 表示 Nestin 與 DAPI 共標(biāo)記代表陽性細(xì)胞。Scale bar=50 μm3. Olig2 干擾慢病毒感染時間的確定對海馬 NSCs 分別進(jìn)行 24 h、48 h、72 h 慢病毒感染處理，結(jié)果顯示：細(xì)胞的熒光強(qiáng)度隨感染時間的增加而增強(qiáng)，72 h 熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)將海馬 NS的感染時間確定為 72 h。（圖 3）
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本文編號：2887602