發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 17:49

　　 目的: 血管性癡呆(vascular dementia,VD)是指由各種腦血管病(cerebrovascular disease,CVD)包括梗死、出血和低灌注等導(dǎo)致的癡呆綜合征。VD在卒中病人中發(fā)病率約為12%～36.3%,居各類癡呆發(fā)病原因的第二位。VD患者的生活質(zhì)量和生存期限受到嚴(yán)重影響。因此,對VD患者進(jìn)行有效治療成為目前神經(jīng)內(nèi)科臨床急需關(guān)注和亟需解決的問題。 干細(xì)胞具有自我增殖和多向分化潛能,用于神經(jīng)內(nèi)科疾病治療,如阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)、帕金森病(Parkinson disease, PD)、缺血性腦血管病、脊髓損傷及遺傳變性疾病等,并取得了一定的效果,成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)。 近年來許多研究證明人臍血(human umbilical cord blood, HUCB)中含有豐富的干細(xì)胞。其中干細(xì)胞可分為造血干細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)兩種成份。HUCB中的造血干細(xì)胞應(yīng)用于臨床已經(jīng)多年,具有良好的安全性和臨床效果。HUCB-MSCs具有較強(qiáng)的可塑性,能發(fā)育成多種細(xì)胞,如成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞等,成為人MSCs的重要來源。實(shí)驗(yàn)證明HUCB來源的MSCs比骨髓MSCs具有更多的分化潛力。HUCB-MSCs經(jīng)誘導(dǎo)可分化為神經(jīng)細(xì)胞,用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療取得了一定的成果。國內(nèi)學(xué)者將HUCB干細(xì)胞用于VD的治療,證明可以使動(dòng)物在行為學(xué)上有所改善。 單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(Monosialoganglioside,GM1)廣泛存在于細(xì)胞外表面,在神經(jīng)系統(tǒng)含量豐富,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有促進(jìn)生長發(fā)育及損傷后保護(hù)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明不同途徑給予GM1均可增加老年鼠腦海馬區(qū)蛋白激酶含量,提高其對神經(jīng)營養(yǎng)因子:神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的反應(yīng)能力。 為探討HUCB-MSCs移植治療VD的作用及GM1腹腔注射是否對該治療具有協(xié)同作用,本文將從HUCB中分離出單個(gè)核細(xì)胞(Mononuclear cells, MNCs),經(jīng)多次傳代獲得MSCs,經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定,用5-溴-脫氧尿嘧啶核苷( 5-Bromodeoxyuridine,BrDU )標(biāo)記后移植到2-血管阻斷(2-vessel occlusion, 2-VO)VD模型大鼠腦內(nèi)海馬CA1區(qū),免疫組織化學(xué)方法了解移植細(xì)胞在大鼠腦內(nèi)的存活、遷移情況及其對大鼠腦組織的影響;Morris水迷宮( Morris Water Maze, MWM)比較移植前后大鼠的行為學(xué)。同時(shí)行GM1腹腔注射,了解GM1在細(xì)胞移植治療VD時(shí)是否具有協(xié)同作用。 材料和方法: 1、人臍血的采集、分離、培養(yǎng)與純化:臍血由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院產(chǎn)科提供。無菌條件下采集健康、足月產(chǎn)婦胎盤臍帶靜脈血,用肝素抗凝采血袋收集,每份臍血50～100 ml。沉淀紅細(xì)胞,疊加于相對密度1.077的Ficoll人淋巴細(xì)胞分離液上,離心機(jī)2000轉(zhuǎn)/分離心30min,取界面層單核細(xì)胞,洗滌兩次,于DMEM+20%胎牛血清中培養(yǎng),經(jīng)3~5次傳代至細(xì)胞生長成均一長梭形間充質(zhì)樣細(xì)胞。 2、HUCB-MSCs的流式細(xì)胞儀鑒定:取培養(yǎng)的HUCB-MSCs洗滌后按1×105/ml個(gè)細(xì)胞加入Eppendoff管,每管50ul。分別加入鼠抗人FITC及PE抗體CD29、CD34、CD44、CD45、CD105;陰性對照管分別加入抗鼠的FITC及PE單克隆抗體;室溫孵育20 min,流式細(xì)胞儀檢測。 3、大鼠2-VO癡呆模型的制作:選取清潔級成年Sprague-Dawley(SD)大鼠120只,3～4月齡,雌雄不拘,體質(zhì)量260 g～320 g,永久結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈制作VD模型,以Morris水迷宮鑒定手術(shù)效果。 4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將手術(shù)后的大鼠依次編號,以隨機(jī)數(shù)法將大鼠隨機(jī)分為模型組(Model Group,n=30)、細(xì)胞移植組(cell transplant group, n=30),GM1組(GM1 injection group, n=30)和細(xì)胞移植聯(lián)合GM1注射組(簡稱聯(lián)合治療組)(combination treatment group, n=30)。模型組及各治療組又分為術(shù)后1天(1d)、3天(3d)、1周(1w)、2周(2w)、3周(3w)、4周(4w)各亞組,每亞組各5只大鼠。對照組(Control Group,n=5)不進(jìn)行手術(shù)。 5、HUCB-MSCs的BrDU標(biāo)記:將傳代得到的HUCB-MSCs加入終濃度為10μmol/L的BrDU共培養(yǎng)48 h,并行BrDU免疫熒光染色,計(jì)算標(biāo)記率。 6、HUCB-MSCs移植于2-VO癡呆模型大鼠腦內(nèi)海馬CA1區(qū):用鼠腦立體定向儀將標(biāo)記的HUCB-MSCs立體定向注射到細(xì)胞移植組和聯(lián)合治療組大鼠腦內(nèi)海馬CA1區(qū)。 7、細(xì)胞移植效果的鑒定: ①移植細(xì)胞存活情況鑒定:采用免疫組織化學(xué)染色對大鼠腦組織內(nèi)的BrDU陽性細(xì)胞進(jìn)行鑒定,并了解BrDU標(biāo)記細(xì)胞存活及其在注射周圍區(qū)遷移情況; ②腦內(nèi)生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43, GAP-43)陽性細(xì)胞增殖情況:采用免疫組織化學(xué)染色了解各組大鼠腦內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)GAP-43陽性細(xì)胞增殖情況; ③大鼠行為學(xué)測定:用Morris水迷宮系統(tǒng)比較各組術(shù)后4w大鼠行為學(xué)。 8、GM1腹腔注射:GM注射組及聯(lián)合治療組腹腔注射GM1連續(xù)14天。 9、GM1聯(lián)合治療效果鑒定:鑒定指標(biāo)同7。 結(jié)果: 1、HUCB中分離培養(yǎng)出MSCs:分離出的HUCB-MNCs呈小圓形,在光鏡下顏色較深,并不停振動(dòng)。培養(yǎng)及傳代后長成大小均一的小長梭形細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測均穩(wěn)定地表達(dá)MSCs相關(guān)的抗原標(biāo)記CD29、CD44、CD105,不表達(dá)造血細(xì)胞系的表面標(biāo)記CD34、CD45,為HUCB中的MSCs。 2、移植細(xì)胞存活情況:免疫組化染色顯示BrDU標(biāo)記的HUCB-MSCs在大鼠腦內(nèi)可以存活,并有在血管周圍聚集的趨勢,隨時(shí)間延長存活細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。 3、GAP-43陽性細(xì)胞增殖情況:免疫組化染色顯示細(xì)胞移植后大鼠腦GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)增多,與模型組相比有顯著差異(P0.05)。 4、大鼠行為學(xué)檢測:Morris水迷宮檢測,VD模型大鼠移植HUCB-MSCs后,找到平臺時(shí)間與模型組相比有顯著差異(P0.05)。 5、GM1治療效果:GM1注射組GAP-43陽性細(xì)胞增殖數(shù)量、大鼠行為學(xué)檢測均較模型組差異顯著(P0.05)。 6、GM1協(xié)同作用:聯(lián)合治療組BrDU陽性細(xì)胞存活數(shù)量在2w、3w、4w與細(xì)胞移植組有顯著差異(P0.05)。聯(lián)合治療組GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)在術(shù)后1w和2w與細(xì)胞移植組及GM1注射組相比更多,有顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論: 1、HUCB中分離的MNCs經(jīng)培養(yǎng)、傳代后可長成大小均一的小長梭形細(xì)胞,為HUCB中的MSCs。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,表達(dá)MSCs表面抗原,具有MSCs的性質(zhì)。提示臍血中存在較為原始的干細(xì)胞,可以應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。 2、HUCB-MSCs標(biāo)記后移植到VD模型大鼠腦內(nèi)海馬CA1區(qū),能夠在大鼠腦內(nèi)存活并增殖,隨著時(shí)間的推移,HUCB-MSCs在大鼠腦內(nèi)遷移。提示HUCB-MSCs可以在大鼠腦內(nèi)存活,是HUCB-MSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)。 3、細(xì)胞移植后,經(jīng)Morris水迷宮檢測,大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯恢復(fù)。證實(shí)HUCB-MSCs移植對VD大鼠的認(rèn)知功能有明顯改善作用。 4、細(xì)胞移植后,大鼠腦內(nèi)的GAP-43陽性細(xì)胞增多。證實(shí)HUCB-MSCs可促進(jìn)大鼠腦內(nèi)細(xì)胞增殖,突觸生長,重塑大鼠腦內(nèi)的細(xì)胞連接,改善大鼠腦功能。 5、細(xì)胞移植同時(shí)給予GM1腹腔注射,大鼠學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)、移植細(xì)胞存活數(shù)量與GAP-43陽性細(xì)胞增殖數(shù)量均增加,說明GM1在細(xì)胞移植治療VD中有協(xié)同作用。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

4：流式細(xì)胞儀檢測 HUCB-MSCs 中不表達(dá)CD34圖 5：流式細(xì)胞儀檢測 HUCB-MSCs 中可表CD44討 論干細(xì)胞是具有自我更新及多向分化潛能的細(xì)胞，其應(yīng)用越來越受到重視。M養(yǎng)中可貼附于塑料培養(yǎng)板表面，培養(yǎng)時(shí)能大量增殖，具有多向分化潛能。在不和誘導(dǎo)條件下，能向中胚層及神經(jīng)外胚層的各類細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等各個(gè)方向分化。HUCB 是胎兒出生時(shí)臍帶內(nèi)及胎盤近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，含有豐富的干細(xì)祖細(xì)胞，其成份可分為造血干細(xì)胞和 MSCs，HUCB 中所含的干細(xì)胞具有較強(qiáng)性，能發(fā)育成多種不同的細(xì)胞，成為人 MSCs 的重要來源。有研究發(fā)現(xiàn) HUCBMSCs 的比例約 35.4% (573 例 HUCB 中 203 例分離培養(yǎng)出 MSCs)，培養(yǎng)基、激

4：流式細(xì)胞儀檢測 HUCB-MSCs 中不表達(dá)CD34圖 5：流式細(xì)胞儀檢測 HUCB-MSCs 中可表CD44討 論干細(xì)胞是具有自我更新及多向分化潛能的細(xì)胞，其應(yīng)用越來越受到重視。M養(yǎng)中可貼附于塑料培養(yǎng)板表面，培養(yǎng)時(shí)能大量增殖，具有多向分化潛能。在不和誘導(dǎo)條件下，能向中胚層及神經(jīng)外胚層的各類細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等各個(gè)方向分化。HUCB 是胎兒出生時(shí)臍帶內(nèi)及胎盤近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，含有豐富的干細(xì)祖細(xì)胞，其成份可分為造血干細(xì)胞和 MSCs，HUCB 中所含的干細(xì)胞具有較強(qiáng)性，能發(fā)育成多種不同的細(xì)胞，成為人 MSCs 的重要來源。有研究發(fā)現(xiàn) HUCBMSCs 的比例約 35.4% (573 例 HUCB 中 203 例分離培養(yǎng)出 MSCs)，培養(yǎng)基、激

圖 1：人臍血單個(gè)核細(xì)胞分離第 2 天(×400) 圖 2：多次換液、培養(yǎng)第 11 天(×400)圖 3：傳代后成小長梭形間充質(zhì)細(xì)胞(×400) 圖 6： BrDU 標(biāo)記細(xì)胞免疫熒光染色(×400)
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2886493