獎賞與厭惡的相關記憶可以影響我們行為上的選擇。成癮性藥物往往會作用于腦中學習記憶相關的通路,將攝入藥物帶來的快感或是藥物戒斷產(chǎn)生的負面情緒與當下所處的環(huán)境因素聯(lián)系起來,形成特定的藥物成癮的關聯(lián)記憶。這些記憶會使藥物戒斷患者在身處相同環(huán)境的情況下有著更高的復吸風險。多巴胺在記憶的形成與表達中有著重要的貢獻。在哺乳動物中,中腦核團腹側被蓋區(qū)(VTA)的多巴胺神經(jīng)元在獎賞相關的學習與記憶形成中起到必不可少的作用。同樣在藥物成癮,例如嗎啡成癮中,VTA處的多巴胺神經(jīng)元介導了嗎啡起始的對動物行為的強化反應以及嗎啡相關的獎賞記憶的形成。腦中諸多結構,如中央杏仁核,伏隔核和腦室周圍的丘腦區(qū)域都被報道參與了正常生理條件和嗎啡成癮狀態(tài)下關聯(lián)記憶的表達。雖然這些結構都接受大量的多巴胺能輸入,但是多巴胺系統(tǒng)在關聯(lián)記憶的表達,特別是嗎啡成癮記憶表達中的確切作用和具體的神經(jīng)環(huán)路機制仍不清楚。本文中,我們在小鼠中縫背核(DRN)發(fā)現(xiàn)了一群特異的多巴胺神經(jīng)元。利用光纖記錄系統(tǒng)和基于腺病毒相關病毒特異表達的鈣離子濃度指示蛋白,我們發(fā)現(xiàn)這群神經(jīng)元可以被獎賞刺激,如蔗糖水,高脂食物和社交隔離后的社交行為所激活。它們對不同大小的蔗糖水的反應隨著獎賞變大而變大,對同樣質(zhì)量的高脂食物可根據(jù)自身狀態(tài)的不同做出不同的反應,并且對暗示蔗糖水的聲音有學習效果。除了獎賞,DRN多巴胺神經(jīng)元也可被電擊所興奮,并且同樣表現(xiàn)出了對暗示電擊的聲音的學習能力。利用光遺傳學與條件位置偏好行為范式,我們發(fā)現(xiàn)這群神經(jīng)元在高脂食物關聯(lián)記憶的表達階段,而非記憶的形成階段至關重要。利用聽覺暗示的條件恐懼測試,我們發(fā)現(xiàn)DRN多巴胺神經(jīng)元在恐懼記憶的形成與表達中均起到作用。這些結果說明了 DRN多巴胺神經(jīng)元在生理條件下對小鼠獎賞與厭惡相關記憶的表達必不可少。之后,我們檢測了這群神經(jīng)元是否在嗎啡成癮的獎賞關聯(lián)記憶與戒斷的厭惡關聯(lián)記憶中起到了與生理條件下類此的效果。通過c-Fos免疫染色和光纖記錄實驗,我們發(fā)現(xiàn)DRN多巴胺神經(jīng)元在嗎啡引起的條件位置偏好實驗(CPP)的測試階段嗎啡關聯(lián)箱體中被特異性激活;在測試階段,而非訓練階段抑制這群神經(jīng)元的發(fā)放可以阻斷嗎啡位置偏好的形成。利用相同的方法,我們觀察到DRN多巴胺神經(jīng)元在自發(fā)性嗎啡戒斷反應引起的條件位置厭惡實驗訓練階段的第4天和測試階段均被興奮;在這兩個階段抑制神經(jīng)元活性均可導致條件位置厭惡程度的降低。并且,損毀這群神經(jīng)元對嗎啡戒斷的生理癥狀并無影響。這些結果說明DRN多巴胺神經(jīng)元在正常生理條件和嗎啡成癮中對獎賞與厭惡相關記憶的表達都至關重要。最后,利用狂犬病毒單突觸逆向追蹤篩選的方法,我們找到了在嗎啡成癮狀態(tài)下DRN多巴胺神經(jīng)元特異性變化的上游核團——側臂旁核(LPB)。通過體外電生理記錄和條件位置偏好的行為實驗,我們闡明了 LPB神經(jīng)元到DRN多巴胺神經(jīng)元的谷氨酸能通路在生理和嗎啡成癮狀態(tài)下對獎賞信息的傳遞十分重要。綜上所述,我們的結果表明DRN多巴胺神經(jīng)元在記憶表達的調(diào)控中的重要作用,為干預嗎啡成癮提供潛在靶點。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R749.61
【部分圖文】：

使其能迅速地在有激發(fā)光的條件下產(chǎn)生強烈的綠色熒光。利用ＧＣａＭＰ鈣??離子指示劑與光纖記錄系統(tǒng)，我們可以實時在體觀察中縫背核多巴胺神經(jīng)元對糖水??獎勵的反應（圖３ａ）。我們在ＺＭｒ－Ｃｒｅ轉(zhuǎn)基因小鼠的中縫背核注射了重組酶Ｃｒｅ依賴??的用于表達鈣離子濃度指示劑的腺病毒相關病毒ＡＡＶ－ＤＩ０－ＧＣａＭＰ６ｍ，并在相同位置??植入事先制作好的光纖陶瓷插芯。通過對酪氨酸羥化酶（ＴＨ，多巴胺神經(jīng)元標志蛋??白）和綠色熒光蛋白（用于指示ＧＣａＭＰ６ｍ所在位置）的免疫熒光染色，大多數(shù)紅??色的ＴＨ陽性細胞均和綠色的表達ＧＣａＭＰ６ｍ蛋白的細胞重合，呈現(xiàn)黃色的熒光信??號（圖３ｂ），說明利用Ｄ／＾－Ｃｒｅ轉(zhuǎn)基因小鼠與Ｃｒｅ依賴的ＧＣａＭＰ６ｍ病毒的確可以高??效而特異地標記多巴胺神經(jīng)元。為了更好地控制每次蔗糖水的攝入量，方便之后分??析中縫背核多巴胺神經(jīng)元對暗示獎賞的聲音的學習效果，我們對表達了?ＧＣａＭＰ６ｍ??蛋白并頭部固定光纖陶瓷插芯的小鼠進行了口腔埋管的手術。通過軟件控制恒流泵

有任何意義的聲音激活的關聯(lián)學習能力呢？為了探宄這個問題，我們將一個聲音同??２０?ｕＬ的蔗糖水聯(lián)系起來，每天訓練小鼠５０次，連續(xù)訓練５天，分析比較中縫背核??多巴胺祌經(jīng)元對聲音和糖水反應的變化（圖４）。從第一天鈣信號記錄的熱圖可以清??楚看到，一開始的訓練回合，聲音所對應的位置（０－２?ｓ）熱圖的顏色為藍色，表示??中縫背核多巴胺神經(jīng)元對其完全沒有反應，相對的，糖水對應的位置（４－５?ｓ）則是??表明強烈激活的亮黃色。但是隨著訓練回合的增多，聲音對應的熱圖顏色逐漸由藍??轉(zhuǎn)黃。通過５只小鼠平均結果的Ｚｓｃｏｒｅ統(tǒng)計圖也可以看出，第一天訓練結束后，小??鼠中縫背核多巴胺神經(jīng)元對聲音己經(jīng)有了一定的興奮反應。??拋＿■■匾??２０?Ｉ?２０ｉ?２０｝?２０?｜?２０?Ｉ??１５?八?１５?１５?１５?１５??＿５２?０?２?４?６?５－２?０?２?４?６?＇＾２?０?２?４?６?＇５－２?０?２?４?６?＇５－２?０?２?４?６??Ｔｉｍｅ?（ｓ）?Ｔｉｍｅ?（ｓ）?Ｔｉｍｅ?（ｓ）?Ｔｔｆｎｅ（ｓ）?Ｔｖｎｅ（ｓ）??圖４連續(xù)５天蔗糖水訓練的鈣信號變化。上側為一只小鼠鈣信號結果的熱圖示意圖，??下側為５只小鼠鈣信號反應平均的Ｚｓｃｏｒｅ統(tǒng)計圖。??如果統(tǒng)計比較聲音對應的０－２ｓ和起始對照－２－Ｏｓ時段Ｚ?ｓｃｏｒｅ統(tǒng)計圖的曲線下面??積，第一天聲音對應的曲線下面積顯著性高于起始對照相對應的值（圖５ｂ），說明??經(jīng)過一天的學習

連續(xù)統(tǒng)計５天聲音對應的Ｚ?ｓｃｏｒｅ統(tǒng)計圖的曲線下面積以及每一天鈣信號反應在??聲音時段的最大值，我們可以看到不管是曲線下面積還是反應峰值，中縫背核多巴??胺神經(jīng)元的反應均呈現(xiàn)顯著的上升趨勢（圖６ａ），說明這群神經(jīng)元具備一定的學習??能力。中縫背核多巴胺神經(jīng)元對蔗糖水的反應的曲線下面積與峰值均有隨著天數(shù)增??加而降低的趨勢，但是并沒有達到統(tǒng)計學的顯著性（圖６ｂ）。??ａ?ｂ?ｃ?ｄ??Ｐ＝?０．０２７６?１５?Ｐ＝?０．０２１２?３〇．?Ｐ＝?０．２９９３?３〇?Ｐ＝?０．１３１７??｜?．?＞?９?？??〇，Ｃ＂?？?＋?Ｖ?？１０?？?？?２０－?＿５＿?？?？?“?？?２０－?？?？??｜〇．Ｔ?．?ＮＳ?．．荽于于?Ｔｌ１。，?？了?Ｔ?．ｆ?ｆ?奮?ｆ??＾?－５－—．?．?．?．?，—?Ｏ＇—？?ｉ?．?ｉ??—友?０＇?ｒ?，?．?ｉ—?０■—．?．?１?．?■—??１?２?３?４?５?１?２?３?４?５?１?２?３?４?５?１?２?３?４?５??Ｄａｉｌｙ?ｓｅｓｓｉｏｎ?Ｄａｉｌｙ?ｓｅｓｓｉｏｎ?Ｄａｉｌｙ?ｓｅｓｓｉｏｎ?Ｄａｉｌｙ?ｓｅｓｓｉｏｎ??圖６中縫背核多巴胺神經(jīng)元對蔗糖水訓練的鈣信號反應統(tǒng)計。（ａ）對暗示糖水的聲??音的鈣信號Ｚｓｃｏｒｅ統(tǒng)計圖的曲線下面積大小比較。（ｂ）對暗示糖水的聲音的鈣信號??峰值大小比較。（ｃ）對蔗糖水的鈣信號Ｚｓｃｏｒｅ統(tǒng)計圖的曲線下面積大小比較。（ｄ）??對蔗糖水的鈣信號峰值大小比較。實驗小鼠只數(shù)為５只：使用的統(tǒng)計學方法為單因??素方差分析（ｏｎｅ－ｗａｙ?ＡＮ０ＶＡ）
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