阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是老年癡呆的最常見類型,其神經(jīng)病理學特征主要表現(xiàn)為沉積在細胞外的老年斑(Senile plaques,SPs)和細胞內聚集的神經(jīng)纖維纏結(Neurofibrillary tangles,NFTs)以及區(qū)域性的神經(jīng)元喪失。目前,對于AD的發(fā)病原因及其病理機制了解甚少,尚沒有有效的治療方法。β-淀粉樣多肽(β-Amyloid peptide,Aβ)是SPs的主要成分,來源于β-淀粉樣多肽前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)的蛋白剪切。大量研究表明Aβ的代謝異�？赡苁茿D起始性的病理環(huán)節(jié)。研究Aβ的代謝對于探討AD的發(fā)病機理較為重要。 硫胺素(Thiamine)即維生素B_1,是人體必需的營養(yǎng)成分。硫胺素在體內主要以焦磷酸硫胺素(Thiamine pyrophosphate,TPP)的形式存在,TPP是糖代謝途徑中的丙酮酸脫氫酶復合體,α-酮戊二酸脫氫酶復合體以及磷酸戊糖途徑中的轉酮醇的輔酶因子。硫胺素在維持腦內氧化代謝平衡方面也發(fā)揮了重要作用。硫胺素缺乏(Thiamine deficiency,TD)會導致以上三種酶類的活性下降、三羧酸循環(huán)發(fā)生障礙、三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)產生受阻。此外,硫胺素缺乏過程中產生了大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),導致了氧化應激的發(fā)生。主要依靠糖代謝提供能量的神經(jīng)組織對硫胺素缺乏高度敏感,硫胺素缺乏的中樞神經(jīng)表現(xiàn)稱為腦型維生素B_1缺乏癥,也稱韋尼克—科爾薩科夫綜合癥(Wernicke-Korsakoff's syndrome,WKS),病人除了有明顯的認知喪失、記憶力減退外,晚期WKS病人出現(xiàn)腦室擴大,神經(jīng)元死亡。其腦內的KGDHC活性也明顯降低。在硫胺素缺乏動物模型上,硫胺素缺乏處理的小鼠腦內出現(xiàn)了神經(jīng)元死亡,小膠質細胞、星型膠質細胞肥大、增生等神經(jīng)退行性疾病的共同病理表現(xiàn)。此外,研究顯示,在AD病人中,TPP含量和TPP依賴型的酶類的活性都有明顯的下降,表明硫胺素缺乏可能在AD病理中起了一定的作用。但硫胺素缺乏在AD中的具體作用尚未得到系統(tǒng)的研究。 我們在體外培養(yǎng)的穩(wěn)定轉染了瑞典型突變APP基因(APPsw)的人源神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y)上和C57BL/6J小鼠上成功誘導了TD模型,并通過酶連免疫吸附實驗、免疫印跡實驗、免疫組織化學等技術手段系統(tǒng)地研究了TD對APP加工(APP processing)的影響以及其可能的機制。 首先,在APPsw SH-SY5Y細胞上,TD處理5天導致了大約13.5%的細胞死亡,發(fā)生凋亡的細胞增加了2倍。MTT法檢測表明TD處理5天導致細胞活力下降了大約50%。第二,酶連免疫吸附實驗測定Aβ的結果顯示:TD處理顯著增加細胞外和細胞內的Aβ的含量。與對照組(胞外的Aβ_(40)和Aβ_(42)分別是5.52±0.12和0.66±0.23 pg/ml·mg)相比,TD5天組胞外的Aβ_(40)和Aβ_(42)分別上升到18.57±2.31和3.85±0.52pg/ml·mg;細胞內的Aβ_(40)和Aβ_(42)分別從對照組的23.4±5.1 7和7.06±1.03 pg/mg分別上升到86.03±8.19和23.52±1.02 pg/mg。第三,免疫印跡實驗顯示在TD過程中,細胞中成熟形式的APP蛋白水平降低,不成熟形式的APP蛋白水平?jīng)]有明顯變化。說明在TD過程中APP的表達水平?jīng)]有增加,應該不是導致Aβ積累的原因。第四,酶活力測定的結果表明負責APP加工的β-分泌酶的活性在TD過程中明顯增高,而γ-分泌酶的活性在這一過程中沒有顯著性變化。前人研究結果證實β-site APP cleaving enzyme 1(BACEl)具有β-分泌酶的活性,我們分別從轉錄以及翻譯水平研究了BACE1基因的表達情況,發(fā)現(xiàn)在TD處理過程中,BACE1基因的mRNA水平?jīng)]有明顯變化,BACE1的蛋白總量也沒有明顯改變。然而,與對照組相比,BACE1蛋白的成熟形式增加了大約2倍,而不成熟形式的BACE1降低了大約50%。表明β-分泌酶的活性調節(jié)不是通過增加BACE1基因的轉錄水平或翻譯水平,而是通過促進BACE1蛋白的翻譯后修飾(BACE1蛋白的成熟過程)來實現(xiàn)的。為了進一步確定β-分泌酶的活性在TD過程中明顯增高,我們檢測了TD過程中β-分泌酶產物:β-C terminalfragment(β-CTF)的變化,免疫印跡結果顯示β-CTF含量在TD過程中明顯增高。第五,TD處理5天后,補充硫胺素24小時明顯地減弱了BACE1蛋白的成熟過程,下調β-分泌酶的活性,降低了Aβ的積累。表明補充硫胺素對TD引起的Aβ的積累具有一定的補救作用。第六,在TD處理5天時,向培養(yǎng)液中添加β-分泌酶抑制劑24小時可以抑制Aβ和β-CTF的積累。第七,TD增加了細胞內活性氧的積累,抗氧化劑Trolox不僅可以降低TD導致的細胞內活性氧的積累,也抑制了BACE1蛋白的成熟過程和Aβ的積累。表明氧化應激可能是TD引起Aβ積累的內在機制。最后,在TD處理過程中,添加低濃度(250pmol/L)的化學合成的Aβ到培養(yǎng)液里明顯加劇了TD導致的氧化應激。表明Aβ的積累增強了TD引發(fā)的氧化應激。 以上的離體實驗結果在TD小鼠模型上得到了驗證:(1)TD處理9天或更長時間會導致丘腦區(qū)域的丘腦中線旁丘腦核(Submedial thalamic nucleus,SmTN)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元死亡;(2)在TD小鼠丘腦區(qū)域,Aβ_(40)和Aβ_(42)含量顯著增加:對照組和TD10天組的Aβ_(40)分別是0.97±0.15和3.34±0.33 pmol/g;Aβ_(42)分別是0.16±0.01和0.49±0.02 pmol/g;(3)TD處理8天后補充硫胺素可以減少丘腦區(qū)域Aβ_(42)的積累。 綜上,我們的實驗結果表明:(1)由TD引起的氧化應激導致了APP蛋白加工過程中產生了更多的Aβ;(2)氧化應激的作用靶點是BACE1蛋白。進一步,TD對β-分泌酶的活性調節(jié)是通過促進BACE1蛋白的翻譯后修飾(BACE1蛋白的成熟過程)來實現(xiàn)的;(3)Aβ的積累也加劇了TD導致的氧化應激。提示氧化應激和Aβ的積累之間存在著正反饋的效應。 本工作發(fā)現(xiàn)硫胺素缺乏引起的氧化應激促進了APP加工中產生更多的Aβ,Aβ的積累反過來加劇了硫胺素缺乏導致的氧化應激。氧化應激和Aβ的積累之間存在著正反饋的效應。這一效應很可能參與了AD的發(fā)生、發(fā)展。最后,體外、體內補充硫胺素實驗都表明及時補充硫胺素可以緩解硫胺素缺乏對APP加工的影響,表明對于出現(xiàn)硫胺素缺乏相關癥狀的AD病人,考慮及時補充硫胺素是有益的。
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2008
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

圖2.p一淀粉樣多膚前體蛋白(Amyloidpreeursorprotein，App)加上(APPproeessing)過程示意圖。A即是一次跨膜的膜蛋白，N端的胞外部分可以被a一分泌酶或p一分泌酶切斷，產生了游離的多膚片段A即sa或者APPsp，剩余的c端片斷仍然留在膜上，因其所含的氨基酸個數(shù)而被稱為C83片段或者C99片段，也稱a一cTF或p一cTF。通過膜上的竹分泌酶的進步剪切，C83片段被切成P3和APPintraeellula:domain(Aleo);e99片段則被切成p一amyloidpeptide(Ap)和AICD(該圖片改畫白FrankM.LaFerla，2005)。其正常的生理功能[l1一13]。在AD病人的腦組織中，構象發(fā)生了改變的Ap聚集并沉積在胞外，與變性的神經(jīng)突起一起構成了SPS，在SPs的周圍常常有激活的膠質細胞【14，15]。Ap假說是目前最廣為接受的關于AD的假說，Ap假說認為Ap的積累是導致AD的初始的和最重要的原因【16]。目一前己知常染色體上的三個基因的突變會導致家族型的阿爾茨海默病(familia:Alzheime:disease，F(xiàn)AD)，分別是21號染色體上的App基因[17]、14號染色體上的早老素l(presenilinl，Psl)基因[18、19]和l號染色體上的早老素2(presenilinZ，psZ)基因【20」。Psl或PsZ基因表達的蛋白與其它3種蛋白組成了Y一分泌酶復合體，負責產生Ap的

圖3.硫胺素(Thiaminedefieieney，TD)缺乏對砂pswsH一sv5y細胞增殖、死亡的影響。A.四種培養(yǎng)條件下細胞的增殖、死亡情況。10倍物鏡下拍攝明場照片。B，MTT法檢測細胞活力的結果，以對照組(Ctrl)為100%。C.AnnexinV+PI雙染色的流式細胞儀分析結果。較大字體的數(shù)值代表AnnexinV陽性細胞的百分比，小字體的數(shù)值為Pl陽性細胞的百分數(shù)。ctrl:完全培養(yǎng)液對照組;Ctri+Py:完全培養(yǎng)液加pyrithiamine組;TDM:硫胺素缺乏培養(yǎng)液組;TDM+即硫胺素缺乏培養(yǎng)液加pyrithiamine組。0day指接種細胞24小時后，更換培養(yǎng)液后這一時間點。(*P<0.05and**P<0.01)綜合上面三個實驗的結果，我們得出以下結論:嚴重的TD會導致APPswSH一SYSY細胞死亡，在本實驗中，我們未觀察到TD對細胞增殖產生明顯影響。此外，單純添加30onmol幾的硫胺素拮抗劑pyrithiamine對細胞沒有產生明顯致死作用。因此，在接下來的體外細胞實驗中，我們選擇了添加pyrithiaminc的TD處理，并將添加300nmol/Lpyrithiamine的處理最長時間點設定在5天;對照組只采用普通的DMEM培養(yǎng)液處理。在這樣的條件下，細胞僅有輕微的死亡發(fā)生，可以最大限度避免因細胞死亡過程中固有的變化被誤認為是由TD處理導致的特

TD導致Ap的積累
【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 錢云;張志珺;;阿爾茨海默病伴抑郁癥的臨床研究進展[J];國際精神病學雜志;2007年03期

2 高麗;;“胰島素在阿爾茨海默病發(fā)病機制中的研究進展”更正啟事[J];中國臨床神經(jīng)科學;2010年04期

3 邢安鳳;霍春月;;中性內肽酶和阿爾茨海默病的基因聯(lián)系[J];北京醫(yī)學;2011年04期

4 姜民慧;;小鼠阿爾茨海默腦病的模型[J];國外醫(yī)學情報;1995年17期

5 ;周圍神經(jīng)及神經(jīng)節(jié)疾病[J];國外科技資料目錄(醫(yī)藥衛(wèi)生);1998年08期

6 盧家紅;;阿爾茨海默病與維生素B12[J];國外醫(yī)學.老年醫(yī)學分冊;1999年06期

7 李瀟;β-secretase與阿爾茨海默病藥物[J];生物化學與生物物理學報;2000年02期

8 許祖年;Alzheimer病39例臨床分析[J];右江民族醫(yī)學院學報;2000年04期

9 相洪琴;;干預阿爾茨海默病的基因療法[J];國外醫(yī)學情報;2000年02期

10 楊靜芳,陳彪,柏華,董秀敏,武劍,陳保生,賈建平;載脂蛋白E基因多態(tài)性與中國人阿爾茨海默病和頸動脈粥樣硬化相關性研究[J];基礎醫(yī)學與臨床;2001年01期

相關博士學位論文 前10條

1 張騎鵬;硫胺素缺乏對β-淀粉樣多肽前體蛋白加工和Aβ生成的作用及機制研究[D];復旦大學;2008年

2 趙長安;鋁致阿爾茨海默病大鼠的效應及補腎填精方的防治機制[D];河北醫(yī)科大學;2002年

3 黃艷紅;植物雌激素對絕經(jīng)后阿爾茨海默病神經(jīng)保護機制的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2004年

4 顧建欽;老年期癡呆的中西醫(yī)結合施治及康復研究[D];華中科技大學;2004年

5 宋陽;核磁共振追蹤外源性的標記細胞在阿爾茨海默病的細胞治療中的應用[D];中國醫(yī)科大學;2006年

6 尹剛;PI3K/AKT信號通路在AD發(fā)病中的作用[D];華中科技大學;2011年

7 杜紅堅;阿爾茨海默病載脂蛋白E基因多態(tài)性及神經(jīng)電生理研究[D];天津醫(yī)科大學;2002年

8 佡劍非;Aβ-AD動物模型建立及NGF治療的實驗研究[D];中國醫(yī)科大學;2005年

9 張葳;雌激素對去卵巢大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護機制的研究[D];吉林大學;2005年

10 周志昆;中藥復方養(yǎng)壽丹對阿爾茨海默病模型海馬區(qū)神經(jīng)免疫調節(jié)機制研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2005年

相關碩士學位論文 前10條

1 陳倢;六味地黃丸對快速老化小鼠學習記憶和細胞因子影響的初步研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2006年

2 何國軍;阿爾茨海默病和血管性癡呆的顱腦核磁共振定量研究[D];第一軍醫(yī)大學;2004年

3 趙琳;維生素E和川芎嗪防治化學藥物誘導的阿爾茨海默病的實驗研究[D];中國醫(yī)科大學;2006年

4 莊瑩;人參皂苷Rg2對阿爾茨海默病大鼠大腦保護作用的研究[D];吉林大學;2007年

5 肖飛;廣東海風藤提取物HS_2對阿爾茨海默病模型的藥效學研究[D];暨南大學;2003年

6 李進;功能磁共振成像對阿爾茨海默病相關認知功能障礙及中藥防治的研究進展[D];北京中醫(yī)藥大學;2007年

7 唐翠松;輕度認知障礙局部腦代謝的~1H-MRS分析[D];蘇州大學;2008年

8 胡薇;小鼠慢性酒精中毒腦神經(jīng)細胞APP和Aβ蛋白的表達[D];中國醫(yī)科大學;2009年

9 譚現(xiàn)偉;Aβ_(1-42)寡聚體制備方法的研究[D];北京交通大學;2009年

10 張曉裕;阿爾茨海默病造模條件的優(yōu)化及去癡靈對該模型的作用[D];暨南大學;2010年

本文編號：2885288