γ分泌酶為介導(dǎo)阿爾茨海默氏病(AD)病理改變的關(guān)鍵酶之一。本文研究了轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白21(TMP21)的γ分泌酶復(fù)合物組分的蛋白表達(dá)量及酶活性的影響。 利用核糖核酸干擾和脫氧核糖核酸超表達(dá)二次轉(zhuǎn)染技術(shù)(siRNA)干擾TMP21在敲除淀粉樣前體蛋白表達(dá)基因的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系(MEF(KO))中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)選用空質(zhì)粒載體為對(duì)照。處理轉(zhuǎn)染組(T)和對(duì)照組(C)細(xì)胞,并收集純化過程中含γ分泌酶復(fù)合物的樣本:破碎細(xì)胞制備全膜蛋白(C_1,T_1):選用CHAPSO進(jìn)一步溶解后超速離心制備所得蛋白(C_2,T_2);用γ分泌酶組分Presenilin-1(PS-1)的特異性抗體免疫沉降C_2或T_2制備IPC_2和IPT_2。 Western blotting檢測(cè)γ分泌酶復(fù)和物重要組分Nicastrin(NCT),PS-1以及TMP21蛋白表達(dá)量;選用飽和濃度的γ分泌酶底物C99,運(yùn)用ELISA檢測(cè)Aβpeptide40和Aβpeptide42的生成總量。 研究得到如下結(jié)果: 1.取新生鼠腦,用CHO溶解hAPP751轉(zhuǎn)基因鼠腦和PS1-/-細(xì)胞運(yùn)用離心,恒溫孵育等手段得到淀粉樣蛋白前體-C末端片段(APP-CTF),并運(yùn)用免疫沉淀(IP),凝膠過濾-高效液相色譜(Gel-HPLC),反向高效液相色譜(PR-HPLC),氨基酸序列分析和質(zhì)譜(MS)法對(duì)APP-CTF的性質(zhì)進(jìn)行了研究。研究表明APP-CTF的膜外切割可能存在一種膜外雙酶(γ分泌酶和ε分泌酶)切切割機(jī)制即可能存在α、β、γ以外的酶切新位點(diǎn)ε。 2.分別用早老蛋白(PS),Nicastrin(NCT),前咽缺陷蛋白-1(APH-1),早老蛋白增強(qiáng)子-2(PEN-2)免疫沉淀(IP)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白21(Transmembrane Protein21,TMP21)研究在鼠腦和HEK293細(xì)胞細(xì)胞系的表達(dá)差異。并進(jìn)一步用蛋白質(zhì)印跡法分析,結(jié)果表明TMP21可能與γ-分泌酶的組成成分Nicastrin(NCT)發(fā)生作用,對(duì)Aβ40和Aβ42的活性有抑制作用。但是具體的結(jié)合區(qū)域還是不清楚,有待于進(jìn)一步的研究工作。 3.本研究構(gòu)建了TMP21的干擾載體,經(jīng)檢測(cè)干擾載體細(xì)胞模型構(gòu)建成功。進(jìn)行干擾載體檢測(cè)時(shí)研究發(fā)現(xiàn)TMP21干擾后,對(duì)PS1復(fù)合物的影響較大,對(duì)Aβ40的產(chǎn)生有較大提高。 4.經(jīng)TMP21 siRNA處理MEF細(xì)胞后,所得樣本T1,T2及IPT2所含TMP21的蛋白表達(dá)量較相應(yīng)對(duì)照組樣本C1,C2和IPC2下降14.8±2.1%,46.5±4.7%及68.9±3.4%,提示轉(zhuǎn)染組MEF細(xì)胞中TMP21表達(dá)被成功干擾。而轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組中,構(gòu)成γ分泌酶復(fù)合物的重要組分NCT與PS-1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。同時(shí),參照樣本C1,C2及IPC2,樣本T1,T2及IPT2中所含γ分泌酶活性分別升高13.9%(p=0.24),87.2%(p＜0.001),211.4%(p＜0.001)。 5.經(jīng)TMP21 cDNA處理MEF細(xì)胞后,所得樣本T1,T2及IPT2所含TMP21的蛋白表達(dá)量較相應(yīng)對(duì)照組樣本C1,C2和IPC2上升16.9±2.1%,上升44.7±4.7%及64.5±3.4%,提示轉(zhuǎn)染組MEF細(xì)胞中TMP21表達(dá)被成功超表達(dá)。而轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組中,構(gòu)成γ分泌酶復(fù)合物的重要組分NCT與PS-1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。同時(shí),參照樣本C1,C2及IPC2,樣本T1,T2及IPT2中所含γ分泌酶活性分別下降11.6%(p=0.24),85.1%(p＜0.001),198.4%(p＜0.001)。 6.有上述結(jié)論可以得出:TMP21可與PS-1共沉降,提示TMP21為γ分泌酶復(fù)合物的組分之一。MEF細(xì)胞中,在TMP21低蛋白表達(dá)狀態(tài)下/高表達(dá)狀態(tài)下,γ分泌酶活性升高/減低,且不影響其他組分的表達(dá)水平,提示TMP21為γ分泌酶的負(fù)調(diào)控因子之一。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

SolubleeytoPlas血eC一terminalfrag功ents班e油rane一assoeiatedPutativeCTFg/111價(jià)舊noaffinityPurifieationGel一filtrationHPLC報(bào)asssPectro功etryN一termin已a(bǔ).a.sequeneing分離得到的片段蛋白質(zhì)印跡結(jié)果(圖1.1)上舊0.

圖1.2CHO溶解的細(xì)胞用APP751中，體外進(jìn)行其APP一CTF的梯度分離鑒定Figure】.5GenerationofCytoPlasmieC一terminalFragmentofAPPinvi介’O一CHOPSI一介中對(duì)產(chǎn)生Ap的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果(圖1.3)PSICl下pCTFQCTF丫I一卜ApPresenilin一KO圖l.3PSI敲除后對(duì)Ap的影響-

圖1.4通過凝膠電泳純化溶解的和膜上的CTF丫Figurel.4Purifieationofsolubleandmembrane一assoeiatedPutativeCTFgbygel一filtration溶解的C丁卜APP反向高效液相色譜結(jié)果(圖1.5)由圖可知:片段52和53為研究所需要的目的片段(抗體為APP全長(zhǎng)抗體)Soluble喂0000CCCCC呢呢呢刀刀刀舊T叫閃O8101214161820Ti此恤動(dòng)
【參考文獻(xiàn)】

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1 周建,王小行,高小平,mail.sc.cninfo.net;轉(zhuǎn)移緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)印跡的影響[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2000年03期

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