發(fā)布時間：2020-11-13 13:41

　　 阿爾茨海默癥(Alzheimer's Disease,AD)是影響全球數(shù)百萬人并與年齡有關(guān)的神經(jīng)性疾病。其主要的病理標(biāo)志特征是β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)的沉積和tau蛋白的過磷酸化,分別形成細(xì)胞外斑塊和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)。這個過程的許多機(jī)制細(xì)節(jié)仍然是未知的,但蛋白質(zhì)聚集的一個確定結(jié)果是阿爾茨海默癥腦中的突觸功能障礙和神經(jīng)元損失,包括線粒體功能障礙,氧化應(yīng)激,炎癥和金屬代謝在內(nèi)的不同途徑都被認(rèn)為與這一過程有關(guān)。金屬離子如銅,鋅和鐵在健康和疾病狀態(tài)的大腦中均發(fā)揮重要作用,并且金屬離子在體內(nèi)含量和分布的變化是不同神經(jīng)退行性疾病和衰老的共同特征。阿爾茨海默癥標(biāo)志性蛋白和其中的金屬結(jié)合性質(zhì)可能是病理生理過程中重要的生物化學(xué)基礎(chǔ)。本文建立了一種基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的對腦組織中Aβ蛋白進(jìn)行絕對定量的方法。測量生物樣品中低豐度的Aβ1-40是阿爾茨海默癥研究中一個有意義的指標(biāo)。以13C標(biāo)記的Aβ1--40蛋白為內(nèi)標(biāo),利用Aβ1-40蛋白三種抗體M3.2、4G8、11A50B的共同作用進(jìn)行免疫沉淀,酸性(pH=2)70℃加熱條件下洗脫,并與基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)聯(lián)用,Aβ1-40蛋白標(biāo)準(zhǔn)品回收率可達(dá)到48.7%。利用該方法和ELISA試劑盒法分別測定小鼠腦組織勻漿上清中Aβ1-40的含量,兩者沒有顯著性差異(p0.1),該方法特異性好,并且操作簡單,重復(fù)性、準(zhǔn)確度好,更適用于市面上沒有對應(yīng)ELISA試劑盒的蛋白。本文還建立了 ID-ICP-MS方法,測定小鼠腦組織的皮層、海馬、丘腦及其他腦區(qū)中的鐵、銅、鋅三種元素含量,并對檢測限、定量限、精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果顯示,相比于對照鼠,模型組鼠腦中鐵、銅、鋅在不同腦區(qū)中的含量有明顯差異。銅、鋅元素主要沉積在小鼠海馬、皮層腦區(qū),而鐵元素主要沉積在小鼠海馬區(qū)域。利用ELISA方法測定模型組與對照組小鼠不同腦區(qū)中的蛋白含量,以探究與阿爾茲海默癥有關(guān)的蛋白和金屬間的關(guān)系。結(jié)果表明,Aβ1-40蛋白、Aβ1-42蛋白、淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)、tau蛋白均是海馬、皮層中的含量較高,且模型組含量高于對照組,這與鐵、銅、鋅在各腦區(qū)中的分布很類似。而金屬硫蛋白-3(Metallothionein-3,MT-3)在模型組小鼠各腦區(qū)中含量均低于對照組,且各腦區(qū)中含量差異不大。通過查閱文獻(xiàn),對所得的各蛋白和金屬間的關(guān)系進(jìn)行了機(jī)理方面的解釋。本文新建立了兩種方法分別定量小鼠腦組織中的蛋白和小鼠各腦區(qū)中的金屬元素,并且探究了小鼠各腦區(qū)中蛋白與金屬間的關(guān)系,為探索阿爾茲海默癥中的金屬與蛋白間的關(guān)系提供了參考,也為疾病標(biāo)志物的定量研究開辟了新思路。
【學(xué)位單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

ａｓｍａ?ｍｅｍｒａｎｅ??圖１－１?ＡＰＰ酶切生成Ａｐ蛋白示意圖??Ｆｉｇ．１－１?Ｔｈｅ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＡＰＰ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｔｏ?ｇｅｎｅｒａｔｅ?Ａｐ?ｐｒｏｔｅｉｎ．??過程中突觸正常功能的受損、喪失可能與癡呆相關(guān)，或?qū)膊∵M(jìn)。密集的斑塊沉積導(dǎo)致周圍的神經(jīng)突彎曲并改變軌跡，這可導(dǎo)

而形成帶上電荷的離子。此電離儀是適合測定生物大分子的軟電離方式。飛行時間質(zhì)??譜儀可通過檢測生物大分子離子的質(zhì)荷比，得出生物大分子的分子量信息并對生物大??分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行剖析，如下圖１－２所示。??ＭＡＬＤＩ?Ｌｉｎｅａｒ?ＴＯＦ??幽?Ｉ?Ｉ??“?＾?４?ｙ?ＤＥＴＥＣＴＯＲ??Ｉ?Ｈｅａｖｙ?ｉｏｎｓ?Ｌｉｇｈｔ?ｉｏｎｓ?Ｉ??１?０?ＩＩ?丨?Ｐｅｐｔｉｄｅｓ??７Ｈｉｇｈ?ｖｏｌｔａｇｅ?Ｍａｔｒｉｘ??圖１－２?ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ?ＭＳ原理示意圖??Ｆｉｇ．?１－２?Ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ?ＭＳ??ＭＡＬＤＩ分析過程中，通常情況下先將樣品（純品或混合物）和基質(zhì)的溶液預(yù)先??混合，并將２？５?ｐＬ混合溶液直接點(diǎn)到樣品板上，要選擇適當(dāng)?shù)幕w使其在激光器的??發(fā)射波長處具有大的消光系數(shù)。通常使溶劑在室溫和壓力下蒸發(fā)以產(chǎn)生不均勻的結(jié)晶??表面。在質(zhì)譜儀內(nèi)部，激光脈沖到晶體表面，基質(zhì)立即升華，同時分析物分子發(fā)生解??吸和電離。然后測量分析物離子的ｍ／ｚ值。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質(zhì)譜譜圖是ｙ軸上的信號強(qiáng)??度圖和ｘ軸上對應(yīng)的質(zhì)量／電荷值。強(qiáng)度等級是離子的相對豐度，但是通常低于約ｍ／ｚ??５００的區(qū)域沒有被顯示，因?yàn)樗换|(zhì)離子的信號飽和。純化合物的ＭＡＬＤＩ譜圖通??常以質(zhì)子化分子的單電荷離子形式

完成絕對定量需要加入內(nèi)標(biāo)，選擇ｎＣ穩(wěn)定同位素標(biāo)記的Ａ（３Ｍ〇蛋白作為內(nèi)標(biāo)。免疫??沉淀－ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ?ＭＳ定量蛋白原理圖??如下圖１－３所示。??Ｃ?＾?Ｃ?、??Ｘ?二?％詠?＾??ｓ???＼?＜?＾?＼?ｓ＇?＾??Ｓ－?＾??加入同位索內(nèi)標(biāo)?加入抗聯(lián)后的??＿織勾架丨？？髓?富集Ｈ標(biāo)蛋白??，?來?ｊ、?ｊ??震?同位索內(nèi)標(biāo)?＾??＾?ＭＡＬＤＩ檢測?麟分離及洗滌過程??圖１－３免疫沉淀－ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ定量蛋白原理圖??Ｆｉｇ．?１－３?Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ?－?ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ?ＭＳ??１．３?ＩＤ－ＩＣＰ＿ＭＳ測量各腦區(qū)中的金屬元素??１．３．１阿爾茲海默癥小鼠各腦區(qū)中金屬元素的分布??金屬離子在大腦中起著重要的作用，并且在不同的神經(jīng)退行性疾病中也是指向其??穩(wěn)態(tài)功能障礙的有力證據(jù)，包括第一排過渡金屬，鐵，銅和鋅以及鈣等，其穩(wěn)態(tài)對于??神經(jīng)功能和老化過程都很重要口］。事實(shí)上，與年齡相關(guān)的金屬離子功能障礙改變了??ＡＤ腦內(nèi)有關(guān)區(qū)域中金屬離子的水平，包括在蛋白質(zhì)沉積物中的累積。金屬離子與ＡＤ??病理蛋白之間的相互作用表明蛋白質(zhì)錯誤折疊、聚集與金屬離子穩(wěn)態(tài)之間具有密切關(guān)??系。在ＡＤ患者中
【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2882256