第一部分Tau蛋白磷酸化對(duì)抗細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究 神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)和tau相關(guān)疾病患者腦中典型的病理學(xué)特征之一,NFTs的主要成分是異常過(guò)度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau。AD和tau相關(guān)疾病患者腦內(nèi)大多數(shù)含有NFTs的神經(jīng)元盡管長(zhǎng)期持續(xù)處在促凋亡的環(huán)境中卻不發(fā)生凋亡而是進(jìn)行慢性的退行性變性死亡,目前對(duì)此現(xiàn)象的機(jī)制仍不清楚。本研究在兩種細(xì)胞株鼠成神經(jīng)瘤(mouse Neuroblastoma 2a, N2a)細(xì)胞和人胚腎(Human Embryonic Kidney 293, HEK293)細(xì)胞、大鼠和tau轉(zhuǎn)基因小鼠中探討神經(jīng)細(xì)胞逃逸凋亡及其機(jī)制。結(jié)果顯示:(1)細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)微管相關(guān)蛋白tau顯著抵抗凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,并且同時(shí)伴隨有微管相關(guān)蛋白tau的過(guò)度磷酸化和糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3, GSK-3)的酶活性升高;(2)在過(guò)度表達(dá)微管相關(guān)蛋白tau的細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)GSK-3不僅完全抑制了GSK-3的促凋亡作用,并且使細(xì)胞抵抗凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;(3)細(xì)胞、大鼠和tau轉(zhuǎn)基因小鼠中過(guò)度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau與caspase-3活性片段和(或)濃縮/碎裂的細(xì)胞核不存在共定位,去磷酸化的tau蛋白與caspase-3活性片段和(或)濃縮/碎裂的細(xì)胞核存在共定位;(4)與微管相關(guān)蛋白tau過(guò)度磷酸化相伴隨的是β-catenin的磷酸化水平降低、β-catenin的水平升高和細(xì)胞核轉(zhuǎn)位增加;(5)采用siRNA方法降低β-catenin的水平顯著降低微管相關(guān)蛋白tau的抗凋亡作用;β-catenin的過(guò)度表達(dá)抗凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)獨(dú)創(chuàng)地提出了微管相關(guān)蛋白tau過(guò)度磷酸化的抗凋亡作用:tau蛋白過(guò)度磷酸化抑制GSK-3β對(duì)β-catenin的磷酸化、升高β-catenin的水平和促進(jìn)β-catenin的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位從而使細(xì)胞抵抗凋亡。本研究結(jié)果顯示微管相關(guān)蛋白tau過(guò)度磷酸化使細(xì)胞逃逸滅絕性的凋亡性死亡,為揭示AD和tau相關(guān)疾病患者腦中神經(jīng)退行性變性的本質(zhì)提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 第二部分在N2a細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)dishevelled-1蛋白抑制渥曼青霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架蛋白的過(guò)度磷酸化 神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的特征性病理學(xué)特征之一,NFTs主要是由成對(duì)的螺旋絲(paired helical filaments, PHF)組成,而構(gòu)成PHF的主要蛋白組分是過(guò)度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau。另外,異常過(guò)度磷酸化的神經(jīng)細(xì)絲也是NFTs的組成成分。研究顯示W(wǎng)nt信號(hào)途徑在AD的發(fā)病中起著重要的作用,并且過(guò)度表達(dá)dishevelled-1 (DVL-1)蛋白可以模擬Wnt信號(hào)。目前,DVL-1蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)絲磷酸化的影響以及對(duì)神經(jīng)細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白tau磷酸化的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中,為了探討DVL-1蛋白對(duì)阿爾茨海默病樣骨架蛋白磷酸化的影響,首先,用渥曼青霉素處理鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞2a (mouse Neuroblastoma 2a,N2a)建立細(xì)胞骨架蛋白異常過(guò)度磷酸化的細(xì)胞模型;然后,在N2a細(xì)胞中轉(zhuǎn)染攜帶DVL-1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒過(guò)度表達(dá)DVL-1蛋白,用渥曼青霉素處理細(xì)胞后,采用免疫印跡和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)絲和微管相關(guān)蛋白tau的磷酸化。結(jié)果顯示:神經(jīng)細(xì)絲在SMI31位點(diǎn)和tau蛋白在PHF-1位點(diǎn)的磷酸化在渥曼青霉素處理后1 h和3 h增強(qiáng),6 h恢復(fù)至正常水平;神經(jīng)細(xì)絲和微管相關(guān)蛋白tau磷酸化的高峰分別在渥曼青霉素處理后1 h和3 h;過(guò)度表達(dá)DVL-1蛋白顯著抑制渥曼青霉素誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)絲在SMI31和SMI32位點(diǎn)和微管相關(guān)蛋白tau在PHF-1 (Ser-396/404)、M4 (Thr-231/Ser-235)和Tau-1 (Ser-198/199/202)位點(diǎn)的過(guò)度磷酸化。綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn):在N2a細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)DVL-1蛋白能夠顯著抑制渥曼青霉素誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)絲和微管相關(guān)蛋白tau的過(guò)度磷酸化。 第三部分DVL-1 cDNA重組質(zhì)粒在N2a細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá) 目的將鼠dishevelled-1 (DVL-1) cDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a (mouse Neuroblastoma 2a),建立瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),為研究Wnt信號(hào)途徑在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)發(fā)病中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法用常規(guī)分子生物學(xué)方法擴(kuò)增和純化DVL-1 cDNA重組質(zhì)粒,用紫外分光技術(shù)檢測(cè)純化質(zhì)粒的純度;用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)的鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a,用免疫印跡和免疫熒光方法從蛋白質(zhì)水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染和表達(dá)效果。結(jié)果質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果顯示:鼠DVL-1 cDNA重組質(zhì)粒PCS2+MT-MDVL1擴(kuò)增和純化成功,純度達(dá)到要求;免疫印跡和免疫熒光結(jié)果顯示鼠DVL-1 cDNA重組質(zhì)粒在鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a中獲得表達(dá),基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)率為57.6%。結(jié)論成功將鼠DVL-1 cDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a中,并獲得瞬時(shí)表達(dá)。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R749.16
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一部分 Tau 蛋白磷酸化對(duì)抗細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
    創(chuàng)新點(diǎn)
    參考文獻(xiàn)
第二部分 在N2a 細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)dishevelled-1 蛋白抑制渥曼青霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架蛋白的過(guò)度磷酸化
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
    創(chuàng)新點(diǎn)
    參考文獻(xiàn)
第三部分 DVL-1 cDNA 重組質(zhì)粒在N2a 細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
    創(chuàng)新點(diǎn)
    參考文獻(xiàn)
綜述
附錄:博士期間發(fā)表文章
致謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳曉釬,烏維寧,于常海;14-3-3:保護(hù)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2004年03期

2 徐雅飛,張永杰,王建枝;多肽脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶與阿爾茨海默病[J];生命的化學(xué);2004年04期

本文編號(hào)：2866759