慢性炎癥是AD的主要病理改變之一,近年研究顯示導(dǎo)致慢性炎癥的主要原因是炎癥消散障礙。炎癥消散由炎癥消散因子SPMs介導(dǎo)。已有研究證實炎癥消散因子Ma R1能提高神經(jīng)元生存率并增強小膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ42的吞噬,但是Ma R1在AD患者海馬和內(nèi)嗅皮質(zhì)顯著減低,Ma R1降低可引起Aβ清除障礙、過度沉積,進(jìn)而加重炎癥反應(yīng),導(dǎo)致慢性炎癥。因此給予Ma R1誘導(dǎo)炎癥消散可能成為治療AD的新方法。研究目的:明確Ma R1對小膠質(zhì)細(xì)胞趨化、激活、表型的極化、炎性因子分泌的影響和相關(guān)信號通路,進(jìn)而對AD小鼠行為學(xué)的影響。研究方法:第一部分體外實驗:1.Ma R1對小膠質(zhì)細(xì)胞趨化的影響的研究:原代神經(jīng)元種于6孔培養(yǎng)板底部,趨化小室置于6孔板中,將綠色熒光標(biāo)記物CFSE標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞種于趨化小室中。實驗分八組:Vehicle組(即正常對照組)、Aβ42組、Aβ42+低濃度Ma R1組(0.005μmol/L)、Aβ42+中濃度Ma R1組(0.05μmol/L)、Aβ42+高濃度Ma R1組(0.5μmol/L)、低濃度Ma R1組(0.005μmol/L)、中濃度Ma R1組(0.05μmol/L)、高濃度Ma R1組(0.5μmol/L)。于6、16、24h后流式細(xì)胞儀檢測CFSE陽性細(xì)胞數(shù)分析小膠質(zhì)細(xì)胞趨化。2.Ma R1對小膠質(zhì)細(xì)胞表型及激活“開-關(guān)”信號的影響:前期實驗發(fā)現(xiàn)Ma R1濃度變化對小膠質(zhì)細(xì)胞趨化影響不大,故以下實驗Ma R1只采用一個濃度;只在6h時間點各組趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目有統(tǒng)計學(xué)差異,故以下實驗只選取6h時間點。小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)24h后,實驗分組:Vehicle組、Aβ42組、Ma R1組、Aβ42+Ma R1組。6h后流式細(xì)胞儀分析小膠質(zhì)細(xì)胞激活“開-關(guān)”信號CD200-CD200R、表型CD40、CD183變化;CBA方法檢測共培養(yǎng)細(xì)胞上清中炎性因子、趨化因子改變;蛋白質(zhì)組學(xué)篩選出現(xiàn)改變的蛋白通路,并用western blot方法進(jìn)行驗證。第二部分體內(nèi)實驗:3-4月齡雄性C57BL6/J小鼠40只,隨機分為Vehicle組、Aβ42組、Ma R1組、Aβ42+Ma R1組。Aβ42組小鼠采用雙側(cè)海馬注射Aβ42制作AD動物模型,Ma R1組和Aβ42+Ma R1組于海馬注射前腦室內(nèi)注射Ma R1。造模后7d利用水迷宮評價小鼠行為學(xué)改變;Fluoro-Jade B染色及免疫組織化學(xué)染色方法觀察海馬和皮層神經(jīng)元退變和膠質(zhì)細(xì)胞活化;CBA和ELISA方法檢測海馬和皮層腦組織炎性因子、趨化因子水平;western blot方法檢測體外實驗中蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)改變的蛋白通路。研究結(jié)果:第一部分體外實驗:1.與Vehicle組相比,Aβ42組趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加(P0.05);Aβ42+低濃度Ma R1組、Aβ42+中濃度Ma R1組、Aβ42+高濃度Ma R1組均較Aβ42組趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目降低(P0.05),但三種濃度組之間趨化細(xì)胞數(shù)目無顯著性差異。與Vehicle組相比,未加Aβ42的單純低濃度Ma R1組、中濃度Ma R1組和高濃度Ma R1組趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目均降低,但只有低濃度Ma R1組和高濃度Ma R1組達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且高濃度Ma R1組降低小膠質(zhì)細(xì)胞趨化作用更明顯(P0.01)。2.在共培養(yǎng)細(xì)胞模型中,與Vehicle組相比,Aβ42組CD200R表達(dá)降低(P0.05);Aβ42+Ma R1組較Aβ42組CD200R表達(dá)升高(P0.05)。四組CD200、CD40、CD183表達(dá)未見顯著性差異。3.在共培養(yǎng)細(xì)胞模型中,與Vehicle組相比,Aβ42組促炎性細(xì)胞因子TNF-ɑ、IL-6、趨化因子MCP-1分泌增加,抗炎性細(xì)胞因子IL-10分泌降低(P0.05);與Aβ42組相比,Aβ42+Ma R1組TNF-ɑ、IL-6分泌降低(P0.05),MCP-1分泌有降低趨勢,IL-10分泌有增加趨勢,但是未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義;與Vehicle組相比,單純Ma R1組IL-6分泌降低(P0.01)。4.定量蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了四組間不同的分子變化:與Vehicle組相比,Aβ42組p-PI3K/total-PI3K、p-AKT/total-AKT表達(dá)降低(P0.01),p-p38/total-p38、p-ERK/total-ERK、p-m TOR/total-m TOR、caspase3、p75NTR、Cdc42表達(dá)升高(P0.05);與Aβ42組相比,Aβ42+Ma R1組p-PI3K/total-PI3K、p-AKT/total-AKT、p-ERK/total-ERK表達(dá)升高(P0.05),p-p38/total-p38、p-m TOR/total-m TOR、caspase3、p75NTR、Cdc42表達(dá)降低(P0.05)。Western blot驗證結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果趨勢一致。第二部分體內(nèi)實驗:1.行為學(xué):Morris水迷宮實驗連續(xù)訓(xùn)練5天后,各組小鼠的逃避潛伏期逐漸縮短。在第5天,與Vehicle組相比,Aβ42組逃避潛伏期明顯延長(P0.05);與Aβ42組相比,Aβ42+Ma R1組逃避潛伏期明顯縮短(P0.01);Vehicle組和Ma R1組逃避潛伏期無明顯差異。在探索實驗中,Aβ42組小鼠穿越平臺次數(shù)及目標(biāo)象限停留時間明顯少于Vehicle組(P0.001);Aβ42+Ma R1組小鼠穿越平臺次數(shù)及目標(biāo)象限停留時間高于Aβ42組(P0.05);Vehicle組和Ma R1組小鼠穿越平臺次數(shù)及目標(biāo)象限停留時間無明顯差異。2.病理:(1)Fluoro-Jade B染色:在海馬與皮層,與Vehicle組相比,Aβ42組退變神經(jīng)元數(shù)目增多(P0.001);Aβ42+Ma R1組較Aβ42組退變神經(jīng)元數(shù)目減少(P0.001);Vehicle組和Ma R1組退變神經(jīng)元數(shù)目無明顯差異。(2)免疫組織化學(xué)染色:在海馬與皮層,與Vehicle組相比,Aβ42組CD11b和GFAP陽性細(xì)胞面積百分比升高(P0.01);Aβ42+Ma R1組較Aβ42組CD11b和GFAP陽性細(xì)胞面積百分比降低(P0.01);Vehicle組和Ma R1組CD11b和GFAP陽性細(xì)胞面積百分比無明顯差異。3.腦組織炎性因子與趨化因子分泌:在海馬與皮層,與Vehicle組相比,Aβ42組TNF-ɑ、IL-6、MCP-1升高(P0.05);Aβ42+Ma R1組較Aβ42組TNF-ɑ、IL-6、MCP-1降低(P0.05);Vehicle組和Ma R1組TNF-ɑ、IL-6、MCP-1無明顯差異。在海馬與皮層,與Vehicle組相比,Aβ42組IL-2、IL-10升高(P0.05);在海馬,Ma R1組較Vehicle組IL-2、IL-10升高(P0.05);在皮層,Aβ42+Ma R1組較Vehicle組IL-2、IL-10升高(P0.05)。4.蛋白通路改變:與Vehicle組相比,Aβ42組p-PI3K/total-PI3K和p-AKT/total-AKT表達(dá)降低(P0.001),p-p38/total-p38、p-ERK/total-ERK、p-m TOR/total-m TOR、caspase3表達(dá)升高(P0.01);與Aβ42組相比,Aβ42+Ma R1組p-PI3K/total-PI3K、p-AKT/total-AKT和p-ERK/total-ERK表達(dá)升高(P0.05),p-p38/total-p38、p-m TOR/total-m TOR、caspase3表達(dá)降低(P0.05);與Vehicle組相比,Ma R1組p-ERK/total-ERK表達(dá)升高(P0.01)。研究結(jié)論:1.Ma R1降低小膠質(zhì)細(xì)胞趨化,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化。2.Ma R1降低促炎性細(xì)胞因子和趨化因子分泌,增加抗炎性細(xì)胞因子分泌。3.Ma R1通過影響細(xì)胞存活、自噬、軸索形成、抑制凋亡蛋白及炎癥通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。4.Ma R1減輕AD小鼠腦組織病理改變,改善AD小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能障礙。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

第 2 章 MaR1 減輕 AD 細(xì)胞模型炎癥反應(yīng)及其發(fā)揮保護(hù)作用的機制表 2.1 實驗試劑與材料中文名稱 生產(chǎn)廠家(0.25%) 胰酶 Life Scienoxyfluorescein Diacetate,ster (5(6)-CFDA, SE; CFSE)sCFSE 染料 Life Scien 兔抗小鼠 CD40 抗體 BD Bioscib 兔抗小鼠 CD183 抗體 BD Biosciation Kit CBA 小鼠炎性因子測試試劑盒 BD Biosci路線aR1 對小膠質(zhì)細(xì)胞趨化的影響流程圖

e Inflammation Kit CBA 小鼠炎性因子測試試劑盒 BD Biosciences.2 技術(shù)路線（1）MaR1 對小膠質(zhì)細(xì)胞趨化的影響流程圖圖 2.1 MaR1 對小膠質(zhì)細(xì)胞趨化的影響流程圖（2）MaR1 對小膠質(zhì)細(xì)胞表型及激活“開-關(guān)信號”影響流程圖

lexa-conjugated（-488, or-647）抗兔、抗大鼠二抗孵育，最后用含 DA共聚焦顯微鏡（型號：Olympus Fluoview, FV1000）觀察細(xì)胞。細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞儀檢測神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面標(biāo)記物表達(dá)。收獲共培養(yǎng)細(xì)胞BSA 的 PBS 溶液重懸。細(xì)胞懸液分別與 CD40、CD183、CD200、CD抗體孵育30min。用1ml PBS沖洗一次，再用300μl 1%多聚甲醛固定45tessa 流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行分析。ometric BeadsArray（CBA）分析養(yǎng)液上清炎性因子和趨化因子采用 CBA 方法檢測。制備標(biāo)準(zhǔn)品
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