晝夜節(jié)律是所有生物體內(nèi)廣泛存在的現(xiàn)象,它使各種行為、生化和生理過程與環(huán)境因素的變化同步。晝夜節(jié)律紊亂的人群患神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加,阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病,許多患者發(fā)病早期便出現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律和睡眠紊亂,β-淀粉樣蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)作為AD最重要的病理特征之一與疾病發(fā)展有關(guān)。伴有Aβ斑塊形成的三轉(zhuǎn)基因AD模型(3x Tg-AD)小鼠表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律紊亂,然而Aβ本身是否會(huì)引起晝夜節(jié)律紊亂尚不清楚。針對AD患者出現(xiàn)的晝夜節(jié)律紊亂,目前臨床上尚無有效的治療手段。Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)與AD在發(fā)病上具有相關(guān)性,T2DM的治療藥物——胰高血糖素樣肽1(Glucagon like peptide 1,GLP-1)的受體激動(dòng)劑Exendin-4已被證實(shí)可以有效改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的下降,但是Exendin-4是否可以逆轉(zhuǎn)Aβ所致晝夜節(jié)律紊亂尚不清楚。目前Exendin-4發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用多采用有創(chuàng)的側(cè)腦室或海馬內(nèi)給藥,鼻腔給藥作為神經(jīng)保護(hù)性藥物的新型給藥方式,近年來被廣泛關(guān)注。因此,本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性的對Exendin-4采用鼻腔滴液的方式進(jìn)行給藥,通過ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)Exendin-4可以到達(dá)海馬組織,利用小鼠自主跑輪行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察鼻腔給予Exendin-4明顯改善Aβ31-35引起的小鼠晝夜節(jié)律紊亂,并且在分子水平通過Real-time PCR證實(shí)Exendin-4可部分逆轉(zhuǎn)Aβ31-35所致視交叉上核(Suprachiasmatic Nucleus,SCN)中生物鐘基因per1及per2基因表達(dá)的改變,旨在為改善AD患者晝夜節(jié)律紊亂提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。第一部分海馬內(nèi)注射Aβ31-35引起C57BL/6小鼠晝夜節(jié)律紊亂目的:觀察Aβ31-35經(jīng)海馬內(nèi)注射后對小鼠晝夜節(jié)律的影響。方法:通過三維腦立體定位儀分別將高壓滅菌三蒸水(Aβ31-35的溶劑)、Aβ31-35注射入海馬,設(shè)立為Vehicle組及Aβ31-35組;隨后將這兩組小鼠放入跑輪裝置,設(shè)置12:12光照——黑暗(Light-Dark,LD)一周后持續(xù)黑暗(Constant darkness,DD)兩周,通過Vital View數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)及Acti View生物節(jié)律分析系統(tǒng)檢測兩組小鼠跑輪運(yùn)動(dòng)的晝夜節(jié)律。結(jié)果:在LD環(huán)境中,兩組小鼠均表現(xiàn)出穩(wěn)定的、接近24 h的晝夜節(jié)律,活動(dòng)期——靜止期分界明顯。在DD環(huán)境下,Vehicle組小鼠的內(nèi)源性晝夜節(jié)律依然存在,睡眠相——運(yùn)動(dòng)相分界明顯,自由運(yùn)轉(zhuǎn)周期為:23.54±0.11 h;Aβ31-35組小鼠則表現(xiàn)出較為分散的跑輪運(yùn)動(dòng),其晝夜節(jié)律發(fā)生明顯改變,自由運(yùn)轉(zhuǎn)周期比Vehicle組明顯延長,為23.69±0.06 h(P(27)0.05)。同時(shí),海馬內(nèi)注射Aβ31-35明顯降低小鼠的跑輪運(yùn)動(dòng)量,為719.3±107.0 counts/h,與Vehicle組(1113.2±133.8 counts/h)相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P(27)0.05)。結(jié)論:Aβ31-35經(jīng)海馬內(nèi)注射可以引起C57BL/6小鼠晝夜節(jié)律紊亂及運(yùn)動(dòng)活性下降。第二部分鼻腔給予Exendin-4可以進(jìn)入C57BL/6小鼠海馬組織目的:觀察Exendin-4經(jīng)鼻腔給藥后進(jìn)入小鼠海馬組織的情況。方法:(1)鼻腔給藥:保持小鼠清醒狀態(tài),一手固定小鼠頭部,暴露鼻腔,另一手操作移液槍采用滴液的方式進(jìn)行給藥。(2)鼻腔給予高壓滅菌三蒸水(Exendin-4的溶劑)設(shè)為Vehicle組;將25 nmol/kg body weight(bw)Exendin-4經(jīng)鼻腔給予C57BL/6小鼠,利用ELISA實(shí)驗(yàn)對給藥10 min、30 min及3 h后的小鼠海馬組織進(jìn)行Exendin-4含量檢測。(3)分別經(jīng)鼻腔給予C57BL/6小鼠高壓滅菌三蒸水、5 nmol/kg bw Exendin-4、25nmol/kg bw Exendin-4,30 min后提取小鼠海馬及大腦皮層組織,采用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測Exendin-4在兩個(gè)組織中的含量。結(jié)果:(1)鼻腔給予25 nmol/kg bw Exendin-4,10 min后小鼠海馬組織中Exendin-4含量與Vehicle組相比無明顯增加;30 min實(shí)驗(yàn)組及3 h實(shí)驗(yàn)組Exendin-4在海馬組織中的含量水平明顯高于Vehicle組(P(27)0.05);但與30 min實(shí)驗(yàn)組相比,給藥3 h后海馬中Exendin-4含量明顯降低(P(27)0.05)。(2)與Vehicle組相比,5 nmol/kg bw Exendin-4實(shí)驗(yàn)組與25 nmol/kg bw Exendin-4實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬組織中Exendin-4含量明顯升高(P(27)0.05),且25 nmol/kg bw實(shí)驗(yàn)組中Exendin-4在海馬組織的水平高于5 nmol/kg bw實(shí)驗(yàn)組(P(27)0.05)。同時(shí)Vehicle組、5 nmol/kg bw實(shí)驗(yàn)組及25 nmol/kg bw實(shí)驗(yàn)組的小鼠大腦皮層中Exendin-4含量無明顯差異,且三組的含量均低于海馬組織(P(27)0.05)。結(jié)論:鼻腔給予Exendin-4可以進(jìn)入C57BL/6小鼠的海馬組織,且進(jìn)入海馬組織的量高于大腦皮層。第三部分鼻腔給予Exendin-4改善Aβ31-35所致C57BL/6小鼠晝夜節(jié)律紊亂及可能機(jī)制目的:觀察鼻腔給予Exendin-4對Aβ31-35所致晝夜節(jié)律紊亂的影響及可能機(jī)制。方法:Exendin-4鼻腔預(yù)處理的方法:25 nmol/kg body weight的Exendin-4經(jīng)鼻腔給藥后計(jì)時(shí),2 h后重復(fù)給藥1次,隨后將小鼠麻醉,經(jīng)海馬內(nèi)注射Aβ31-35;將Vehicle組、Aβ31-35組、Exendin-4預(yù)處理組及Exendin-4單獨(dú)給藥組小鼠放入跑輪裝置,設(shè)置LD一周后DD兩周,觀察小鼠跑輪運(yùn)動(dòng)的晝夜節(jié)律;隨后根據(jù)小鼠在DD環(huán)境下晝夜時(shí)間(Circadian time,CT),于CT2、CT8、CT14及CT20四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別提取四組小鼠的SCN,通過Real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測per1基因及per2基因的變化情況。結(jié)果:在DD環(huán)境下,Exendin-4鼻腔預(yù)處理組小鼠出現(xiàn)較清晰的運(yùn)動(dòng)相——休息相,與Aβ31-35組相比,自由運(yùn)轉(zhuǎn)周期明顯縮短,為23.56±0.07 h(P0.05);同時(shí),鼻腔單獨(dú)給予Exendin-4并不影響小鼠自身節(jié)律,自由運(yùn)轉(zhuǎn)周期為23.50±0.05 h。Aβ31-35破壞了SCN組織中per1及per2基因表達(dá)的節(jié)律振蕩;Aβ31-35引起小鼠SCN組織中per1基因在CT14的表達(dá)量(1.09±0.18)較Vehicle組(1.53±0.35)明顯降低(P0.05);Exendin-4預(yù)處理部分糾正了per1基因的異常表達(dá)(1.43±0.34);Exendin-4單獨(dú)給藥并不影響SCN中per1基因在4個(gè)CT的表達(dá)。同時(shí),Aβ31-35引起小鼠SCN組織中per2基因在CT8的表達(dá)量(0.99±0.10)降低,與Vehicle組(1.47±0.35)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Exendin-4預(yù)處理改善了per2基因異常表達(dá),為1.40±0.38;Exendin-4本身不影響per2基因在4個(gè)CT的表達(dá)。結(jié)論:鼻腔給予Exendin-4可以明顯改善Aβ31-35所致C57BL/6小鼠晝夜節(jié)律紊亂,且有可能是通過調(diào)整per1及per2基因的異常表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R749.16
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 海馬內(nèi)注射Aβ31-35引起C57BL/6 小鼠晝夜節(jié)律紊亂
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組
        1.2 試劑與儀器
        1.3 Aβ31-35海馬內(nèi)給藥
        1.4 小鼠自主跑輪行為學(xué)實(shí)驗(yàn)
        1.5 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果
        2.1 C57BL/6 小鼠表現(xiàn)出穩(wěn)定的晝夜節(jié)律
        2.2 Aβ31-35導(dǎo)致C57BL/6 小鼠晝夜節(jié)律紊亂
        2.3 Aβ31-35導(dǎo)致C57BL/6 小鼠跑輪運(yùn)動(dòng)活性明顯下降
    3 討論
    4 結(jié)論
        4.1 Aβ31-35海馬內(nèi)注射可以引起C57BL/6 小鼠晝夜節(jié)律的紊亂
        4.2 Aβ31-35海馬內(nèi)注射可以引起C57BL/6 小鼠運(yùn)動(dòng)活性的明顯降低
第二部分 鼻腔給予Exendin-4 可以進(jìn)入C57BL/6 小鼠海馬組織
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組
        1.2 試劑與儀器
        1.3 Exendin-4 鼻腔給藥的方法
        1.4 ELISA實(shí)驗(yàn)
        1.5 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果
        2.1 Exendin-4 經(jīng)鼻腔給藥后可以進(jìn)入小鼠海馬組織
        2.2 Exendin-4 經(jīng)鼻腔給藥后進(jìn)入小鼠海馬組織的含量高于大腦皮層
    3 討論
    4 結(jié)論
        4.1 鼻腔給予Exendin-4 可以進(jìn)入C57BL/6 小鼠的海馬組織
        4.2 Exendin-4 經(jīng)鼻腔給藥后進(jìn)入海馬的量明顯高于大腦皮層
第三部分 鼻腔給予Exendin-4 改善Aβ31-35所致C57BL/6 小鼠晝夜節(jié)律紊亂及可能機(jī)制
    1 材料和方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)分組
        1.2 試劑與儀器
        1.3 Exendin-4 鼻腔預(yù)處理的方法
        1.4 Aβ31-35海馬內(nèi)給藥
        1.5 小鼠自主跑輪行為學(xué)實(shí)驗(yàn)
        1.6 Real-time PCR
        1.7 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果
        2.1 鼻腔給予Exendin-4 改善Aβ31-35所致C57BL/6 小鼠晝夜節(jié)律紊亂
        2.2 鼻腔給予Exendin-4 改善Aβ31-35所致C57BL/6 小鼠跑輪運(yùn)動(dòng)活性下降
        2.3 Exendin-4 調(diào)整了Aβ31-35所致小鼠SCN組織中per1基因表達(dá)的改變
        2.4 Exendin-4 調(diào)整了Aβ31-35所致小鼠SCN組織中per2基因表達(dá)的改變
    3 討論
    4 結(jié)論
        4.1 鼻腔給予Exendin-4 預(yù)處理后，可明顯改善Aβ31-35經(jīng)海馬內(nèi)注射引起的小鼠晝夜節(jié)律的紊亂及運(yùn)動(dòng)活性的下降
        4.2 Exendin-4 拮抗Aβ31-35所致晝夜節(jié)律紊亂的作用有可能是通過調(diào)整per1及per2基因的表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)的
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
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本文編號：2845211