目的：①建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的分離、培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染技術(shù)；②篩選BMSCs、Noggin和腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)基因修飾的BMSCs、羥基紅花黃色素A (hydroxysafflor yellow A, HSYA)口重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS)等干預(yù)血管性癡呆(vascular dementia)大鼠的方法,結(jié)合大鼠空間記憶力和海馬區(qū)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達(dá)分析其效果；③將大鼠海馬區(qū)長時程增強(qiáng)(long-term potentiation, LTP)與BDNF和N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDAR)不同亞單位的表達(dá)結(jié)合,分析VaD大鼠空間記憶改善的機(jī)理。 方法：①提取大鼠長骨骨髓中的BMSCs,對其進(jìn)行傳代培養(yǎng),通過MTT等方法計算細(xì)胞活力,通過流式細(xì)胞技術(shù)、成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)技術(shù)對其進(jìn)行鑒定；②選取第3至第5代的BMSCs進(jìn)行Noggin和BDNF基因轉(zhuǎn)染,以VVestern blotting(?)勺方法檢測BMSCs目的蛋白的表達(dá)；③采用2VO法制作VaD大鼠模型,實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、PBS組、生理鹽水組、BMSCs組、Noggin修飾BMSCs組、BDNF修飾BMSCs組、HSYA組和rTMS組；④對造模后1周的VaD大鼠分別給予BMSCs移植、轉(zhuǎn)染Noggin的BMSCs移植、轉(zhuǎn)染BDNF的BMSCs移植、HSYA尾靜脈注射2周和高頻rTMS4周；⑤造模后5周行水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠的空間記憶功能,行LTP實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠海馬區(qū)的突觸可塑性,以Western blotting的方法檢測各組大鼠海馬區(qū)VEGF、 BDNF、NR1、NR2A和NR2B的表達(dá),以HE染色觀察各組大鼠海馬區(qū)的結(jié)構(gòu),以免疫組化的方法檢測各組大鼠海馬區(qū)VEGF和NR1的表達(dá)。 結(jié)果：①通過一般形態(tài)學(xué)的觀察、流式細(xì)胞技術(shù)、成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)等鑒定方法顯示,貼壁法分離、培養(yǎng)BMSCs可以有效達(dá)到純化的目的；②通過熒光顯微鏡下觀察和Western blotting法檢測目的蛋白的表達(dá),顯示重組腺病毒Ad-GFP-Noggin和Ad-GFP-BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs,可使BMSCs高效表達(dá)Noggin和BDNF;③HE染色結(jié)果顯示2VO法制作血管性癡呆模型,可以模擬人類血管性癡呆的病理表現(xiàn),而各干預(yù)組均可使其病理變化得到改善；④水迷宮結(jié)果顯不BMSCs移植、Noggin和BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs移植、HSYA和rTMS均可改善VaD大鼠的空間記憶功能,且Noggin和BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs組優(yōu)于單純給予BMSCs組；⑤Western blotting和免疫組化的結(jié)果顯示,VaD模型組大鼠海馬區(qū)VEGF表達(dá)輕度上調(diào),HSYA和BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs可以顯著上調(diào)VEGF的表達(dá),其余各干預(yù)組增加VEGF表達(dá)的作用相對較��；⑥LTP結(jié)果顯示,各干預(yù)組均明顯優(yōu)于VaD模型組,以Noggin、BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs組和rTMS組為著；⑦Western blotting和免疫組化的結(jié)果顯示各干預(yù)組均可使海馬區(qū)BDNF、NR1和NR2B的表達(dá)上調(diào),以BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs組和rTMS組為著,而各組對NR2A均無顯著影響。 結(jié)論：①貼壁篩選法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs,可獲得純度和活力均較高的BMSCs;②Noggin、BDNF對BMSCs的存活和分化具有重要意義,有望臨床應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)染BMSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病；③BDNF基因修飾的BMSCs既能修復(fù)受損的記憶功能和突觸效能,又可促進(jìn)血管生成,其總體效果優(yōu)于單純的BMSCs移植和Noggin基因修飾的BMSCs移植,對VaD有良好的治療前景；④HSYA可明顯促進(jìn)血管生成,rTMS可顯著調(diào)節(jié)突觸可塑性,有望將二者聯(lián)合用于臨床治療VaD患者；⑤LTP的形成與BDNF和NMDAR有密切關(guān)系,其中NMDAR主要是NR1和NR2B的活化,而不是NR2A; BMSCs、Noggin基因轉(zhuǎn)染BMSCs、BDNF基因轉(zhuǎn)染BMSCs、HSYA和rTMS可能都是通過此途徑而改善VaD大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R749.1
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語/符號說明
前言
    研究現(xiàn)狀、成果
    研究目的、方法
一、大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及Noggin、BDNF基因轉(zhuǎn)染
    1.1 對象和方法
        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
        1.1.2 主要儀器
        1.1.3 主要試劑及耗材
        1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑配置方法
        1.1.5 大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
        1.1.6 Noggin、BDNF基因轉(zhuǎn)染BMSCs
        1.1.7 統(tǒng)計學(xué)分析
    1.2 結(jié)果
        1.2.1 大鼠BMSCs的分離和培養(yǎng)
        1.2.2 大鼠BMSCs的生長曲線
        1.2.3 臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞活力
        1.2.4 大鼠BMSCs的鑒定
        1.2.5 重組腺病毒介導(dǎo)Noggin、BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs及轉(zhuǎn)染效率的測定
        1.2.6 Western blotting法檢測目的蛋白的表達(dá)
    1.3 討論
        1.3.1 大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定方法
        1.3.2 Noggin和BDNF對BMSCs存活和分化的作用
        1.3.3 神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾BMSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究現(xiàn)狀
    1.4 小結(jié)
二、Noggin、BDNF基因修飾的BMSCs、HSYA和rTMS對VaD大鼠空間記憶和VEGF表達(dá)的影響
    2.1 對象和方法
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 主要試劑及耗材
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑配置方法
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)方法
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)
        2.2.2 Western blotting檢測海馬區(qū)VEGF的表達(dá)
        2.2.3 海馬區(qū)HE染色
        2.2.4 免疫組化檢測海馬區(qū)VEGF的表達(dá)
    2.3 討論
        2.3.1 血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制及治療展望
        2.3.2 水迷宮在學(xué)習(xí)記憶過程研究中的作用
        2.3.3 VEGF促進(jìn)血管生成和神經(jīng)保護(hù)作用
        2.3.4 BMSCs、Noggin、BDNF、HSYA和rTMS對血管生成的影響
    2.4 小結(jié)
三、Noggin、BDNF基因修飾的BMSCs、HSYA和rTMS對VaD大鼠LTP、BDNF和NMDAR的影響
    3.1 對象和方法
        3.1.1 主要儀器
        3.1.2 主要試劑及耗材
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑配置方法
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)方法
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 海馬CA3-CA1區(qū)LTP
        3.2.2 Western blotting檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)
        3.2.3 免疫組化檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)
    3.3 討論
        3.3.1 LTP的形成機(jī)制及其在探討突觸可塑性中的作用
        3.3.2 NMDAR在學(xué)習(xí)記憶過程中的作用
        3.3.3 BDNF、Noggin與LTP和NMDAR的關(guān)系
        3.3.4 HSYA的神經(jīng)保護(hù)作用
        3.3.5 rTMS對學(xué)習(xí)記憶過程的調(diào)節(jié)
    3.4 小結(jié)
全文結(jié)論
論文創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文和參加科研情況說明
綜述 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)營養(yǎng)因子治療血管性癡呆的研究進(jìn)展
    綜述參考文獻(xiàn)
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2844161