研究背景 胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是糖尿病重要的發(fā)病機(jī)制之一,貫穿于糖尿病的發(fā)生、發(fā)展全過程,同時也是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的根源。流行病學(xué)研究顯示:胰島素抵抗綜合征患者心血管疾病和腦卒中的風(fēng)險增加3倍,病死率明顯增高。 研究結(jié)果顯示,胰島素抵抗是認(rèn)知功能下降的重要危險因素。認(rèn)知功能損害早期主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶功能的下降。中樞膽堿能系統(tǒng)在學(xué)習(xí)和記憶行為中有重要的調(diào)節(jié)作用,保持其功能正常,是維持哺乳動物學(xué)習(xí)記憶的必要條件。胰島素抵抗以高胰島素血癥、糖脂代謝紊亂等為主要特征。而長期高血糖能引起機(jī)體內(nèi)多種物質(zhì)發(fā)生糖基化反應(yīng),產(chǎn)生糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts,AGEs)。近來的研究顯示:糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end product,RAGE)通路激活是糖尿病靶器官損害的重要機(jī)制之一,該通路活性增強(qiáng)與衰老、認(rèn)知障礙及外周神經(jīng)病變有密切的關(guān)系。吡格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物,是一種新型的胰島素增敏劑,通過增加組織對胰島素的敏感性改善胰島素抵抗,降低血糖水平,其生物學(xué)效應(yīng)主要是通過激活過氧化物酶體增殖物活化受體γ(Peroxisome Proliferator-activatedreceptor gammar,PPARγ)實現(xiàn)的。有研究報道PPARγ激活劑能夠減少缺血再灌注腦梗塞體積,具有腦保護(hù)作用。 目前國內(nèi)未見對胰島素抵抗時認(rèn)知功能下降機(jī)制以及PPARγ激活劑對中樞AGEs-RAGE信號通路影響的研究報道。 目的 (1)探討高果糖誘發(fā)的胰島素抵抗大鼠認(rèn)知功能、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(cholineacetyltransferase,ChAT)活性及胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)的變化 (2)探討高果糖誘發(fā)的胰島素抵抗大鼠腦組織AGEs-RAGE損傷途徑的變化。 (3)探討吡格列酮(Pioglitazone,PIO)在胰島素抵抗大鼠腦損傷中的作用及機(jī)制 方法 45只6～8周齡清潔級健康雄性Wistar大鼠(購于山東大學(xué)實驗動物中心),體重180～200g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,從中隨機(jī)選取10只作為正常組(NC組),標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng),飲用自來水;其余35只標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng),飲用10%的果糖水,(參考Reaven GM)制作胰島素抵抗模型。4周后根據(jù)胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index,IRI)將制作成功的胰島素抵抗模型動物隨機(jī)分為胰島素抵抗組(IR組)和吡格列酮組(PIO組)。吡格列酮干預(yù)方法:在檢測模型成功后,IR組及PIO組繼續(xù)標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng),飲用10%的果糖水至實驗結(jié)束,PIO組同時按10 mg/(kg·d)灌胃給藥,NC組與IR組灌服相應(yīng)體積的生理鹽水,共計12周。干預(yù)12周后,進(jìn)行以下測試:1.測定各組大鼠體重、血糖、胰島素水平,計算胰島素抵抗指數(shù);2.通過Morris水迷宮實驗觀察大鼠認(rèn)知功能改變情況;3.比色法測定腦組織中ChAT活性;4.免疫熒光檢測腦組織AGEs的表達(dá);5.Western blot腦組織中PPARγ、RAGE、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Phospho-NF-κB p65,Ser536)、IGF-1表達(dá)。6.對腦組織切片進(jìn)行尼氏染色,以觀測各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)及尼氏體改變 結(jié)果 1各組大鼠體重、空腹血糖、胰島素水平的比較 干預(yù)第12周末IR組、PIO組大鼠體重、空腹血糖較NC組有增高趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);IR組胰島素水平較NC組明顯增高(P＜0.01),PIO組胰島素水平較NC組增高(P＜0.05);PIO組胰島素水平明顯低于IR組(P＜0.01)。 2 Morris水迷宮實驗成績比較 IR組逃避潛伏期較NC組明顯延長(P＜0.01),PIO組逃避潛伏期較NC組延長(P＜0.05),PIO組逃避潛伏期較IR組明顯縮短(P＜0.01) 3.膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性比較 與NC組(69.042±7.6603)比較IR組(36.9225±5.0859)ChAT活性降低,差異有顯著性(P＜0.01)。與IR組比較PIO組(50.0825±6.2224)ChAT活性增強(qiáng),差異有顯著性(P＜0.05),但仍低于NC組(P＜0.01)。 4.免疫熒光法檢測AGEs的表達(dá) NC組大鼠海馬、皮層細(xì)胞排列密集,可見AGEs在細(xì)胞漿表達(dá),表達(dá)較弱;IR組細(xì)胞排列疏松,AGEs表達(dá)呈強(qiáng)陽性;與IR組相比較,PIO組細(xì)胞排列較緊密;AGEs表達(dá)強(qiáng)度減弱,陽性細(xì)胞數(shù)減少。 5.Western blotting檢測腦組織PPARγ、RAGE、Phospho-NF-κB、IGF-1表達(dá) ①IR組和PIO組RAGE的蛋白表達(dá)水平較NC組升高,分別為NC組的1.68倍、1.24倍;與IR組相比,PIO組RAGE的蛋白表達(dá)水平下降26.2%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 ②IR組和PIO組磷酸化NF-κB的蛋白表達(dá)水平較NC組升高,分別為NC組的1.58倍、1.27倍;與IR組相比,PIO組磷酸化NF-κB的蛋白表達(dá)水平下降19.6%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 ③IR組和PIO組PPARγ的蛋白表達(dá)水平較NC組降低,分別為NC組的0.72%、0.89%;與IR組相比,PIO組的PPARγ蛋白表達(dá)水平升高,為IR組的1.23倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 ④IR組和PIO組IGF-1的蛋白表達(dá)水平較正常對照組降低,分別為NC組的35.7%和48.05%;與IR組相比,PIO組的IGF-1蛋白表達(dá)水平升高,是IR組的1.35倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) 6.組織形態(tài)學(xué)改變 尼氏染色:NC組各腦區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常,胞核膜和核仁清晰;IR組小鼠的額葉皮質(zhì)、海馬的細(xì)胞排列稀疏,細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞胞漿內(nèi)Nissl體減少或消失。PIO組比IR組有所改善,神經(jīng)元細(xì)胞排列尚整齊、密集,胞漿中Nissl體較豐富。 結(jié)論 1.胰島素抵抗大鼠神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生病理性損害,認(rèn)知功能下降,可能與腦組織IGF-1表達(dá)下降,ChAT活性降低,神經(jīng)元凋亡增加,乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)釋放減少有關(guān)。 2.胰島素抵抗大鼠腦皮質(zhì)、海馬區(qū)的AGEs、RAGE、磷酸化NF-κB蛋白表達(dá)增加;PPARγ表達(dá)降低。提示AGEs-RAGE及下游通路的激活可能參與腦組織損傷過程。AGEs-RAGE通路活性增強(qiáng)與PPARγ活性降低有關(guān)。 3.吡格列酮通過促進(jìn)PPARγ表達(dá)增加,增強(qiáng)中樞ChAT活性,增加IGF-1表達(dá),維持膽堿能神經(jīng)功能,對模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能減退具有改善作用。同時吡格列酮通過PPARγ對AGEs-RAGE通路產(chǎn)生抑制作用,繼而改善胰島素抵抗大鼠的認(rèn)知功能。 意義 本課題通過運(yùn)用Western blot、免疫熒光、尼氏染色、比色法等方法,觀察了吡格列酮干預(yù)前后胰島素抵抗大鼠腦組織中AGEs、RAGE、NF-κB、PPARγ、ChAT、IGF-1表達(dá)的變化以及大鼠逃避潛伏期的變化,探討了IGF-1、ChAT在胰島素抵抗大鼠腦組織中的變化,AGEs-RAGE通路在胰島素抵抗腦損傷機(jī)制中的作用,以及吡格列酮對胰島素抵抗大鼠腦組織損傷的作用和對AGEs-RAGE通路的影響,為臨床胰島素抵抗中樞神經(jīng)損傷的防治提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R587.1;R749.1
【部分圖文】：

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IR組PIO組NC組PIO組圖3免疫印跡檢測各組大鼠腦組織即AR丫、RAGEs、phospho一NF一KB蛋白表達(dá)相對數(shù)比較 Fig3TheanalysisofPPARY、 RAGESandPhosPho一NF一沼Protein inratsbyWesternblot、IGF一lexPreSS10n
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本文編號：2843021