1目的 藥物成癮是一個世界范圍內(nèi)日趨嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)和社會問題，世界各國無一幸免地受到毒品的侵襲。藥物成癮是以失去控制能力、強迫性連續(xù)用藥為主要特征的慢性復(fù)發(fā)性腦疾病。成癮行為形成過程中有多種學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)的參與。研究表明，成癮和學(xué)習(xí)記憶過程有很多相同的神經(jīng)生物學(xué)改變，與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的重要腦區(qū)、功能分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與了藥物依賴的形成和心理渴求導(dǎo)致的復(fù)吸。因此，了解有成癮特征化的學(xué)習(xí)記憶機制對探求成癮的本質(zhì)有重要意義。長時程增強(long-term potentiation，LTP)作為學(xué)習(xí)和記憶的模式已經(jīng)得到公認(rèn)，并且是陳述性記憶的分子機制。在LTP誘導(dǎo)過程中必須有Ca~(2+)／鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)參與和活化，CaMKⅡ可能是記憶的分子基礎(chǔ)。CaMKⅡ是學(xué)習(xí)記憶和藥物成癮過程的共同影響因子，可以作為研究藥物成癮和學(xué)習(xí)記憶共同生物學(xué)機制的指標(biāo)。其中CaMKⅡα亞基與空間學(xué)習(xí)能力密切相關(guān)。 針對以上機制，我們的研究集中在目前國際上的一個熱點——芋螺毒素上。芋螺毒素(CTX)是一類來源于海洋軟體生物芋螺(Conus)的活性多肽。芋螺毒素按其作用靶位可分為ω-、δ-、α-和conantokins等類型，其中ω-CTX MVⅡA選擇性作用于N型電壓門控鈣通道(N-VGCCs)，而conantokins選擇性作用于N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體。已有研究表明，鈣離子通道和谷氨酸受體尤其是NMDA受體參與了藥物依賴的形成。其可能的作用途徑是： 本研究利用自行開發(fā)的視頻跟蹤-計算機自動分析CPP模型系統(tǒng)，建立嗎啡誘導(dǎo)的小鼠CPP形成模型，檢測芋螺毒素類似物[Glu~(3，4，7，10，14)]-conantokin G對嗎啡誘導(dǎo)小鼠CPP表達(dá)的影響，評價其在干預(yù)嗎啡精神依賴方面的藥效，與本實驗室前期工作進(jìn)行比較，并探討CaMKⅡ在嗎啡成癮相關(guān)腦區(qū)所起的作用。 2材料和方法 2．1實驗動物 清潔級雄性昆明種小鼠，體重18～20g。獨立通風(fēng)籠具(IVC)飼養(yǎng)，每籠4只，自由攝取食物和水。 2．2藥物 鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥廠)；生理鹽水(浙江平湖莎普愛思制藥有限公司)；[Glu~(3，4，7，10，14)]-conantokin G(Sigma)。anti-CaMKⅡα抗體(Sigma)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(北京中杉生物有限公司)、Monoclonal Anti-β-Actin(Sigma)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(北京中杉生物有限公司)。 2．3 CPP實驗裝置 視頻跟蹤—計算機自動分析CPP模型系統(tǒng)：4個相同的長方形PVC材料穿梭盒(30 cm×15 cm×15 cm)組成一個45 cm×45 cm×15 cm的正方形盒子，每個盒子被一個隔板分成兩個大小相同的正方形盒子(15 cm×15 cm×15 cm)，其中一個盒子四周均為白色，底面光滑，做為伴藥盒；另一個四周均為黑色，底面鏤刻成網(wǎng)格。攝像系統(tǒng)可以完整記錄小鼠的活動情況，采集的視頻圖像用自行開發(fā)的MiceTrack軟件進(jìn)行分析。 2．4 CPP訓(xùn)練程序：包括自然偏愛測試、條件性位置偏愛(CPP)的建立和表達(dá)，具體操作步驟如下： 自然偏愛測試：實驗開始前三天，穿梭盒中間采用通道型隔板，將小鼠放置兩盒交界處，讓其在兩盒內(nèi)自由活動15分鐘，攝錄活動情況，以便分析其天然偏愛情況。 CPP的建立：隔板將穿梭盒分隔成兩個獨立的盒子，實驗組小鼠在d1、d3、d5、d7天給予嗎啡(5 mg／kg)后放置白盒訓(xùn)練50分鐘；d2、d4、d6、d8天給予生理鹽水后放置黑盒訓(xùn)練50分鐘。對照組小鼠均給予生理鹽水，其它處理同實驗組小鼠。 CPP的表達(dá)：在實驗的d9天，將中間隔板換成通道型，小鼠未作任何處理放置兩盒交界處，讓其在兩盒內(nèi)自由活動15分鐘，攝錄其活動情況，用MiceTrack軟件分析小鼠在黑盒和白盒內(nèi)的停留時間，作為位置偏愛的評價指標(biāo)。 2．5芋螺毒素給藥處理 芋螺毒素類似物[Glu~(3，4，7，10，14)]-Conantokin G(Glu-Con G)以生理鹽水做溶劑。在嗎啡誘導(dǎo)CPP表達(dá)測試前半小時，小鼠側(cè)腦室分別給予Glu-Con G 30、60、120 pmol，給藥容量為5μl／只。 2．6 CaMKⅡα表達(dá)量測定步驟： 總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。灌制SDS-PAGE(10％的分離膠和5％的積層膠)，將配成相同蛋白濃度并處理好的蛋白樣品上樣(每孔20μg)，電泳(110 V，1.5 h)，用濕電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜(Amersham公司)(110 V，2 h)。取出膜放入含5％脫脂奶粉的TBST液，室溫輕搖2 h，取出膜，放入anti-CaMKⅡα一抗液(1∶3000稀釋)，4℃孵育過夜。TBST液快速搖洗后(25 min)，將膜放入HRP標(biāo)記的抗兔第二抗體(1∶3000稀釋)，室溫下孵育2小時，TBST液快速搖洗后(25 min)，置等體積ECL A液和ECL B液混合的發(fā)光劑底物液中1 min，曝光1 min后，顯影、定影。用TBST快速洗膜20 min，將膜放入anti-Actin一抗(1∶5000)，室溫孵育2小時；用TBST快速洗膜25 min，將膜放入anti-mouse第二抗體中，溫和振蕩2小時；用TBST快速洗膜25 min；ECL A液和ECL B液等體積混合后，將膜在ECL中溫浴1 min；曝光1 min，將膠片顯影、定影。 2．7實驗觀察指標(biāo)及統(tǒng)計分析 位置偏愛指標(biāo)：白盒(伴藥盒)停留時間；運動活性指標(biāo)：總運動距離；探索活動指標(biāo)：穿梭次數(shù)，總中心徘徊距離，總中心停留時間，白盒中心徘徊距離，白盒中心停留時間。均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P＜0.05視為有統(tǒng)計學(xué)差異。Western blotting膠片用GS-800掃描入計算機，用Biorad quantity one 4．4．0 densitomonter圖像分析軟件計算每張膠片中各條帶的灰度，以相應(yīng)條帶的內(nèi)參Actin的平均灰度做標(biāo)準(zhǔn)，計算CaMKⅡα各條帶與之比較的相對比值，計算其余各條帶與之比較的相對比值，進(jìn)行定量分析。 3結(jié)果 3．1嗎啡誘導(dǎo)的條件性位置偏愛模型的建立 天然偏愛結(jié)果顯示：小鼠在黑盒停留時間(s)較白盒長(分別為504.0±25.1和396.6±25.1，P＜0.05)，對黑盒有所偏愛。 5mg／kg嗎啡組小鼠在白盒停留時間顯著長于對照組(分別為573.2±53.0和441.1±39.3，P＜0.05)，提示小鼠已建立對白盒的偏愛。 3．2芋螺毒素對嗎啡誘導(dǎo)CPP表達(dá)的干預(yù)作用 嗎啡誘導(dǎo)的CPP表達(dá)階段，芋螺毒素類似物Glu-Con G處理組(0、30、60、120 pmol)同嗎啡對照組相比，白盒停留時間呈劑量依賴性減少，各組運動活性及探索活動比較無顯著性差異。相關(guān)性分析后，各組位置偏愛同運動活性及探索活動無相關(guān)性。 3．3芋螺毒素類似物Glu-Con G與GST-CTX MVⅡA及Con G拮抗嗎啡CPP表達(dá)的作用比較 同等劑量(0.003 mg／kg)的芋螺毒素側(cè)腦室給藥，Con G比Glu-Con G干預(yù)小鼠位置偏愛的作用稍強，但兩者之間無顯著性差異；而GST-CTX MVⅡA的有效劑量約為兩者的十倍。 3．4 CaMKⅡα在芋螺毒素GST-CTX MVⅡA干預(yù)嗎啡CPP表達(dá)的前額葉皮質(zhì)(PFC)和海馬(HP)腦區(qū)表達(dá)量的變化 嗎啡組和0.01 mg／kg GST-CTX MVⅡA干預(yù)組PFC和HP腦區(qū)CaMKⅡα蛋白表達(dá)增多，均明顯高于生理鹽水對照組(P＜0.05)；同嗎啡組相比，0.03、0.1 mg／kgGST-CTX MVⅡA干預(yù)組和鹽水組PFC和HP腦區(qū)CaMKⅡα蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)。 4結(jié)論 4．1改進(jìn)、完善的視頻跟蹤—計算機自動分析CPP模型系統(tǒng)能成功分析小鼠位置偏愛指標(biāo)、運動活性指標(biāo)及探索活動指標(biāo)，結(jié)果穩(wěn)定可靠； 4．2 [Glu~(3，4，7，10，14)]-Conantokin G能有效干預(yù)嗎啡誘導(dǎo)的CPP的表達(dá)； 4．3 [Glu~(3，4，7，10，14)]-Conantokin G在本實驗劑量范圍內(nèi)不引起小鼠運動活性及探索活動的異常，小鼠位置偏愛與運動活性及探索活動無相關(guān)性； 4．4 GST-CTX MVⅡA阻斷Ca~(2+)通道，降低CaMKⅡα的表達(dá)水平，為證明CaMKⅡ參與藥物成癮提供了更多實驗依據(jù)。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R749.6
【部分圖文】：

CPP穿梭盒Fig.1TheshuttleboxofCPP

圖2MiceTraek軟件的分析界面Fig.2TheinterfaeeofMieeTraeksoftware(2)其他儀器:超低溫冰箱(美國NBS公司)、電磁爐(美的電磁爐公司)、高速低溫離心機(Eppendorf公司)、制冰機(格蘭特公司)、水平脫色搖床(江

Fig.4Theaequisition inthemornhine一paired圖4 ofCPP嗎啡誘導(dǎo)小鼠CPP的建立 indueedbymorPhine.ThebarsrePresenttimespentcomPartment inthe15min training.Theeontrolgroupreeeivedsaline(1.v. wereinjeetedsaline(i.p.)ormorphine(5mg/kg， testforCPPaftereonditioning everydayandthemorPhinegrouP 1.p.)altematelyinansday seheduleofeonditioning.*valuesare exPressedasthe :P(0.05eomparedwiththesalineeontrolgroup.Themeans士5.E.M.l9
【參考文獻(xiàn)】

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1 魏娟娟;董銘心;肖彩;姜鳳超;戴秋云;;芋螺多肽conantokins及其類似物對小鼠嗎啡戒斷癥狀的抑制作用[J];中國藥物依賴性雜志;2006年02期

2 龍再浩,朱永平,陳惠紅,周連芳;視頻跟蹤-計算機自動分析的小鼠條件性位置偏愛實驗系統(tǒng)的構(gòu)建[J];浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2004年06期

本文編號：2840835