目的:阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)目前是老年人群癡呆的主要原因,隨著人口老齡化的加劇,全球發(fā)病人數(shù)日益增多。由于AD嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量并給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān),因此對于該病的防治顯得尤為重要。AD的臨床表現(xiàn)主要為進(jìn)行性智能減退,病理特征為老年斑(SP)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)、海馬錐體細(xì)胞顆粒空泡變性和神經(jīng)元的缺失。SP的形成與β-樣淀粉蛋白(Aβ)過量產(chǎn)生和沉積有關(guān)。到目前為止,它們與神經(jīng)細(xì)胞退行性變性之間的關(guān)系尚不十分清楚。NFT的主要成分是過度磷酸化的Tau蛋白,它聚積在退行性變性神經(jīng)元的胞體并與AD患者臨床癡呆程度正相關(guān)[1],且Tau蛋白的病理改變出現(xiàn)在癡呆癥狀之前并獨立于Aβ異常[2]。Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白,主要存在于神經(jīng)元,具有促進(jìn)微管組裝和維持微管穩(wěn)定的功能。在AD患者腦中Tau蛋白喪失了正常生理功能,從而纏結(jié)形成NFTs。已知有多種蛋白磷酸酯酶,如PP-2A,PP-l參與Tau蛋白的AD樣異常磷酸化。 茶多酚(tea polyphenol, TP)是從綠茶中提取出來的一種多酚類化合物,其在B-環(huán)和C-環(huán)上的酸性羥基有很強(qiáng)的供氫能力,是天然的抗氧化劑。其抗氧化能力明顯優(yōu)于強(qiáng)氧化劑維生素C、維生素E[3]。大量研究已證實,TP在抑菌、抗病毒、抑制腫瘤、防治心血管疾病等方面具有良好功效,同時還具有益肝保腎作用。且有文獻(xiàn)證實,TP在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中能夠減輕Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[4],而長期給小鼠EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯,茶多酚的主要成分)可以誘導(dǎo)海馬APP水平的下降[5],此外TP還能夠抑制Aβ原纖維的形成、延長和脫穩(wěn)定性[6]。但是TP是否對于AD中Tau蛋白的過度磷酸化具有保護(hù)作用,目前尚無文獻(xiàn)報道。本實驗通過岡田酸(okadaic acid, OA)誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元Tau蛋白過度磷酸化實驗?zāi)Ｐ?研究茶多酚對OA致海馬神經(jīng)元Tau蛋白過度磷酸化的作用及其大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。 方法:選用岡田酸(okadaid acid, OA)來誘導(dǎo)Tau蛋白過度磷酸化。健康雄性SD大鼠共60只,體重250-300g。將大鼠隨機(jī)分為6組,每組10只。包括正常對照組(normal),溶媒對照組(vehicle-control),OA損傷組(OA model)和100 mg/kg、250 mg/kg和625mg/kg不同濃度茶多酚預(yù)處理組(TP)。除正常對照組大鼠外,其它各組大鼠分別灌胃給予等量生理鹽水或不同濃度TP。灌胃至第21天時對各組大鼠進(jìn)行空間學(xué)習(xí)與記憶能力訓(xùn)練和行為學(xué)測試。至第27天時,向右海馬背側(cè)(前囟后3.8mm,中線旁開2.5mm,深度3mm)定向注射OA 1.5μL(0.473μg,10% DMSO),于10min內(nèi)緩慢注射,留針5min。溶媒對照組施以等體積10%DMSO。OA注射后第二天即第28天時,進(jìn)行水迷宮考試,考試后處死大鼠,收集標(biāo)本。制作大鼠右側(cè)腦組織石蠟切片,免疫組織化學(xué)染色觀察腦組織中海馬處磷酸化的Tau蛋白表達(dá)分布情況。Western blot方法檢測腦海馬內(nèi)磷酸化的Tau蛋白的表達(dá)并進(jìn)行定量分析。結(jié)果: 1.TP降低OA致海馬神經(jīng)元過度磷酸化Tau蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示, OA損傷組大鼠海馬神經(jīng)元胞體和突起的Tau-pSer396表達(dá)較正常對照組和溶媒對照組大鼠海馬區(qū)顯著增多,呈現(xiàn)棕黃色染色,TP預(yù)處理組的Tau-pSer396陽性表達(dá)較OA損傷組減少,其中以250mg/kg和625mg/kg劑量組的作用較明顯。Western blot實驗進(jìn)一步證實免疫組化的結(jié)果,定量分析表明,OA損傷組Tau-pSer396的表達(dá)量比正常組和溶媒對照組增加,而TP預(yù)處理各組則比OA損傷組降低,且250 mg/kg和625 mg/kg劑量組降低明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。 2.TP改善OA致大鼠空間記憶障礙 隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加,各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短,在給予OA注射前TP預(yù)處理的三個組大鼠與OA損傷組大鼠相比其逃避潛伏期差異有顯著性(p0.01)。TP預(yù)處理的三個組和OA損傷組大鼠在給予OA前后穿越平臺的次數(shù)經(jīng)Kruskal-Wallis H檢驗有顯著性差異(p0.05)。在總時間一定的情況下,OA損傷組大鼠給予OA后,在目的象限停留時間及在目的象限游泳距離占總游泳距離的百分比顯著降低(p0.01),而TP預(yù)處理的三個組大鼠在OA注射后在目的象限停留時間及在目的象限游泳距離占總游泳距離的百分比無顯著變化。此外,OA注射后,TP預(yù)處理的三個組大鼠較OA損傷組大鼠,在目的象限停留時間及在目的象限游泳距離占總游泳距離的百分比顯著增加(p0.01)。上述結(jié)果表明,岡田酸(OA)使得大鼠空間記憶出現(xiàn)障礙,表現(xiàn)為穿越平臺次數(shù)減少,目的象限停留時間縮短,在目的象限游泳距離占總游泳距離的百分比減少;而茶多酚(TP)預(yù)處理能夠改善大鼠記憶障礙,增強(qiáng)學(xué)習(xí)能力,即縮短逃避潛伏期,增加大鼠穿越平臺的次數(shù)及在目的象限停留的時間,增加在目的象限游泳距離占總游泳距離的百分比并表現(xiàn)出一定的搜索策略。 結(jié)論: 岡田酸能夠誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元Tau蛋白過度磷酸化并引起大鼠空間記憶損傷,茶多酚能夠減輕Tau蛋白的過度磷酸化,改善大鼠記憶損傷狀況。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R285.5;R749.16
【部分圖文】：

圖 2. Ser396 磷酸化 Tau 蛋白在大鼠海馬組織中的分布與表達(dá). The expression of Tau-pSer396 protein in the rat hippocampunohistochemistry. A, B, C, D, E and F represent normal group, vehicle -cp, OA model group and TP groups by doses of 100 mg/kg, 250 mg/kg ang with 100 times magnification；A*, B*, C*, D*, E* and F* are enlarged pi, B, C, D and E respectively with 400 times magnification. Scare bar 25μm海馬組織磷酸化 Tau 蛋白的免疫印跡結(jié)果如圖 3 所示，OA 損組織中 Tau-pSer396 表達(dá)水平明顯升高；TP 預(yù)處理組海馬組織-pSer396 的表達(dá)量較 OA 損傷組降低，且以 250 mg/kg 和 625mg組明顯。對蛋白免疫印跡結(jié)果進(jìn)行點密度半定量分析，OA 損傷-pSer396 表達(dá)量比正常組和溶媒對照組顯著增加（ P < 0.01），而理各組則比 OA 損傷組降低，且 250 mg/kg 和 625mg/kg 劑量組（P < 0.01）。見圖 4。

圖 3. 大鼠海馬組織 Tau 蛋白的免疫印跡Tau-Ser396 expression detected by Western blot in rat hippocampus.1-3 represent 625, 250 and 100 mg/kg TP group respectively, lanes nt OA-model group, vehicle-control and normal groups.00.511.522.533.54625mg/kgTP250mg/kgTP100mg/kgTPOA-modelvehicle-controlnormalelativeRRIithwS396p**####

normvehicel-contOA-mo100mg/kg250mg/kg625mg/kg總的象限游泳距離占目游泳距離的百分比圖 7.各組大鼠在目的象限游泳距離占總游泳距離的百分比Fig.7. Percentage of swimming distance in target quadrant of total that of each ☆ P<0.01 compared to OA model group before OA microinjection, ##Pcompared to normal group, ** P<0.01 compared to OA model group.選擇性搜索策略是指被測試動物在逐漸記憶形成的情況下，在象限的停留時間要多于其它象限的現(xiàn)象。通常情況下受過訓(xùn)練的動目標(biāo)象限出現(xiàn)的頻率會高于其它三個象限。在本實驗中發(fā)現(xiàn)實驗組（大鼠不能表現(xiàn) TP 預(yù)處理組所具有的選擇性搜索策略。而 TP 預(yù)處理表現(xiàn)出了一定的搜索策略。說明了茶多酚處理對其記憶情況的改善見圖 8。
【參考文獻(xiàn)】

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1 魏建設(shè),張玲妹,黃婭琳,朱粹青,孫鳳艷;崗田酸誘導(dǎo)大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT1[J];生理學(xué)報;2002年04期

2 劉世杰,王建枝;渥曼青霉素在體誘導(dǎo)tau蛋白阿爾采末樣磷酸化以及褪黑激素的拮抗作用[J];Acta Pharmacologica Sinica;2002年02期

3 吳琪;Alzheimer病神經(jīng)原纖維纏結(jié)與tau蛋白研究[J];中國神經(jīng)精神疾病雜志;2000年01期

本文編號：2836446