【摘要】：研究目的:蛋氨酸亞砜還原酶B2(Methionine sulfoxide reductase B2,MSRB2)是位于線粒體上的氧化還原酶,具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的作用。MSRB2抗氧化應(yīng)激的能力提示其可能在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的病理生理學(xué)改變中起到一定的作用。本研究觀察MSRB2在AD小鼠動(dòng)物模型(APP/PS1)中的表達(dá)模式并探討其與AD樣病理改變的關(guān)系。研究方法:用Western blot以及免疫組化的方法比較6、18月齡AD和野生型(Wild-type,WT)小鼠的皮質(zhì)和海馬腦組織中MSRB2的表達(dá)。在穩(wěn)定表達(dá)人全長(zhǎng)?-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)序列的HEK-293細(xì)胞中(HEK293 cells stably expressing human full-length APP,HEK/APP)分別轉(zhuǎn)染MSRB2質(zhì)粒使其過表達(dá)、轉(zhuǎn)染MSRB2的短發(fā)夾RNA(Short hairpin RNA,shRNA)使其表達(dá)下調(diào)后,觀察APP代謝通路相關(guān)蛋白,Tau蛋白不同磷酸化位點(diǎn)過度磷酸化水平以及相關(guān)激酶的變化。用免疫熒光的方法檢測(cè)MSRB2與線粒體的共定位關(guān)系。在細(xì)胞中過表達(dá)MSRB2后用免疫熒光以及熒光定量酶標(biāo)儀的方法觀察及檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的表達(dá)水平。并且在過表達(dá)MSRB2后加入過氧化氫(H_2O_2),觀察在氧化應(yīng)激條件下MSRB2是否對(duì)APP異常代謝及Tau的過度磷酸化具有改善作用。使用c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)以及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal regulated kinase,ERK)的抑制劑驗(yàn)證其信號(hào)通路是否涉及MSRB2參與調(diào)節(jié)的APP的轉(zhuǎn)錄水平。用Western blot驗(yàn)證MSRB2是否具有抗凋亡的作用。研究結(jié)果:1.MSRB2的蛋白水平在6月齡及18月齡APP/PS1小鼠的海馬中表達(dá)降低,只在18月齡APP/PS1小鼠的皮層中降低。2.在過表達(dá)MSRB2的HEK/APP細(xì)胞中APP和β-淀粉樣蛋白轉(zhuǎn)化酶1(β-amyloid converting enzyme 1,BACE1)蛋白及mRNA的水平降低,隨之產(chǎn)生的淀粉樣蛋白(Amyloid beta peptide,Aβ)1-40以及Aβ1-42的水平降低。3.MSRB2過表達(dá)以及敲低對(duì)于Tau磷酸化位點(diǎn)和相關(guān)的激酶如p-ERK以及磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶(Phosphorylation of AMP-activated protein kinase,p-AMPK)具有相反的調(diào)節(jié)作用。4.免疫熒光證實(shí)MSRB2定位于線粒體上,并且過表達(dá)MSRB2的細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著低于對(duì)照組。在用過氧化氫(H_2O_2)處理的細(xì)胞中,MSRB2逆轉(zhuǎn)了H_2O_2對(duì)APP與Tau磷酸化的影響。5.進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MSRB2調(diào)節(jié)促進(jìn)APP表達(dá)的信號(hào)通路與JNK及ERK有關(guān)。6.MSRB2過表達(dá)降低凋亡相關(guān)蛋白Bax以及caspase3的表達(dá),并且增強(qiáng)抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl2的表達(dá)。研究結(jié)論:1.MSRB2在AD的動(dòng)物模型中表達(dá)下降,提示與AD的病理機(jī)制密切相關(guān)。2.MSRB2是線粒體源性的酶,能夠影響Aβ的生成和Tau的異常磷酸化,提示線粒體源性的氧化應(yīng)激機(jī)制在AD的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。3.MSRB2影響APP和BACE1的表達(dá)以及Aβ的產(chǎn)生與JNK有關(guān);而對(duì)Tau磷酸化的影響主要與AMPK和ERK信號(hào)通路有關(guān)。4.鑒于MSRB2逆轉(zhuǎn)了氧化應(yīng)激下的這些改變,本研究認(rèn)為抗氧化應(yīng)激機(jī)制是MSRB2的主要作用方式。因此MSRB2也許能為AD治療方面的研究提供新的方向。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R749.16
【圖文】：

圖 1.APP/PS1 小鼠腦組織中 MSRB2 蛋白及免疫組化表達(dá)水平降低igure1. Cerebral MSRB2 protein and immunoreactivity are decreased in APP/PS1 m(A) Western 印跡法檢測(cè)及定量野生型(WT)和 APP/PS1 小鼠皮層中的 MSRB2 蛋白對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，6 月齡(WT 1.00 ± 0.10, n = 5 vs. APP/PS1 0.99 ± 0.09, n = 5; unpair.108, P = 0.9165)，18 月齡(WT 1.00 ± 0.03, n = 5 vs. APP/PS1 0.72 ± 0.06, n = 5; u t = 4.288, P = 0.0027)。(B)Western 印跡法檢測(cè)及定量野生型(WT)和 APP/PS1 小鼠SRB2 蛋白表達(dá)水平和統(tǒng)計(jì)結(jié)果，6 月齡(WT 1.00 ± 0.06, n = 5 vs. APP/PS1 0.67 ± 0paired t-test t = 3.010, P = 0.0168)，18 月齡(WT 1.00 ± 0.11, n = 5 vs. APP/PS1 0.40 ±npaired t-test t = 5.579, P = 0.0037)。** p <0.01，*** p <0.001。(C)免疫組織化學(xué)染SRB2 特異性抗體對(duì) 18 月齡的 WT 及 APP/PS1 小鼠的皮層和海馬中 MSRB2 表達(dá)測(cè)。 與 WT 相比，APP/PS1 小鼠顯示出較低水平的 MSRB2 免疫反應(yīng)性。比例尺=過 Image-pro Plus 6.0 軟件對(duì) MSRB2 表達(dá)水平進(jìn)行定量。皮層：WT 1.00 ± 0.05, nPS1 0.44 ± 0.06, n = 4; unpaired t-test t = 7.168, P = 0.0004。海馬：WT 1.00 ± 0.15, nPS1 0.45 ± 0.03, n = 4; unpaired t-test t = 3.609, P = 0.0320。

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文白表達(dá)水平降低，而總 Tau 和 p-Tau231 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生顯著進(jìn)一步探究哪些激酶可能參與影響了 MSRB2 對(duì) Tau 磷酸化的調(diào)節(jié)，我們表達(dá) MSRB2 的 HEK/APP 細(xì)胞中 GSK3β(p-GSK3β)，ERK(p-ERK)，CdPK(p-AMPK)的蛋白激酶表達(dá)水平。如圖 Fig.3C&D 所示，MSRB2 的過表胞中 p-ERK 和 p-AMPK 的蛋白水平顯著降低，而對(duì) p-GSK3β和 p-Cdk5沒有顯著的影響。與過表達(dá) MSRB2 的結(jié)果相反，敲低 MSRB2 顯著增u396 和 p-Tau262 的蛋白水平，并且對(duì)總 Tau 和 p-Tau231 的蛋白水平未產(chǎn)ig.3E&F)。我們還發(fā)現(xiàn)在使用shRNA敲低MSRB2的細(xì)胞中，p-ERK和p-A水平顯著增加，而 p-GSK3β和 p-Cdk5 蛋白水平仍保持不變(Fig.3G&H)。表明 MSRB2 選擇性的影響 Tau 磷酸化位點(diǎn)的磷酸化水平和相關(guān)激酶 ERPK 的活性。

圖 3. MSRB2 在基礎(chǔ)條件下影響 HEK/APP 細(xì)胞中的 Tau 磷酸化Figure3. MSRB2 affects Tau phosphorylation in HEK/APP cells under basal condition(A&B) 使用 Western blots 對(duì)轉(zhuǎn)染 Vector 或 MSRB2 48 小時(shí)的 HEK/APP 細(xì)胞中總 Tau，p-Tau396，p-Tau262 和 p-Tau231 的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測(cè)以及定量。Total-Tau: Vector 1.00 ± 0.06,n = 6 vs. MSRB2 0.96 ± 0.05, n = 6; unpaired t-test t = 0.564, P = 0.5855. p-Tau396: Vector 1.00 ±0.10, n = 4 vs. MSRB2 0.55 ± 0.07, n = 4; unpaired t-test t = 3.851, P = 0.0085. p-Tau262: Vector1.00 ± 0.09, n = 5 vs. MSRB2 0.55 ± 0.09, n = 5; unpaired t-test t = 3.671, P = 0.0063. p-Tau231:Vector 1.00 ± 0.04, n = 6 vs. MSRB2 1.03 ± 0.04, n = 6; Mann-Whitney test, P = 0.5218。(C&D) 使用Western blots對(duì)Vector或MSRB2轉(zhuǎn)染48小時(shí)的HEK/APP細(xì)胞中p-GSK3β，GSK3β，p-ERK，ERK，Cdk5，p-AMPK 和 AMPK 的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測(cè)以及定量。p-GSK3β: Vector 1.00 ± 0.17,n = 4 vs. MSRB2 0.88 ± 0.12, n = 4; unpaired t-test t = 0.559, P = 0.5965. GSK3β: Vector 1.00 ±0.08, n = 6 vs. MSRB2 1.03 ± 0.04, n = 6; unpaired t-test t = -0.309, P = 0.7636. p-ERK: Vector 1.00± 0.07, n = 4 vs. MSRB2 0.69 ± 0.04, n = 4; Mann-Whitney test, P = 0.0210. ERK: Vector 1.00 ±0.07, n = 4 vs. MSRB2 1.11 ± 0.07, n = 4; Mann-Whitney test, P = 0.1490. Cdk5: Vector 1.00 ± 0.06,n = 5 vs. MSRB2 0.84 ± 0.11, n = 5; unpaired t-test t = 1.317, P = 0.2243. p-AMPK: Vector 1.00 ±0.10, n = 6 vs. MSRB2 0.47 ± 0.04, n = 6; unpaired t-test t = 5.086, P = 0.0005. AMPK: Vector 1.0

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本文編號(hào)：2800051