發(fā)布時(shí)間：2020-08-20 06:21

【摘要】： 目的 創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder, PTSD)是對(duì)刺激因素的一種異常精神反應(yīng)。盡管進(jìn)行了大量的神經(jīng)生物學(xué)研究,但目前對(duì)PTSD的發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚。PTSD臨床表現(xiàn)多樣,主要包括創(chuàng)傷經(jīng)歷再體驗(yàn)、情感麻木與回避行為、警覺(jué)增高所致易激惹癥狀三大癥候群。這些癥狀表明PTSD患者可能存在血中皮質(zhì)醇水平增高的現(xiàn)象。然而,大量研究表明PTSD患者血中皮質(zhì)醇水平比正常人低。目前,在其他抑郁癥的患者中主要存在皮質(zhì)醇負(fù)反饋的抑制,PTSD患者卻有負(fù)反饋增強(qiáng)的現(xiàn)象。目前報(bào)道PTSD患者尿中去甲腎上腺素和腎上腺素的排泄量明顯增加。藍(lán)斑是去甲腎上腺素的主要集中地,另外,藍(lán)斑還參與睡眠障礙,警覺(jué)過(guò)度,易激惹等PTSD臨床癥狀。 皮質(zhì)類固醇受體包括糖皮質(zhì)激素受體(GR,Ⅰ型),和鹽皮質(zhì)激素受體(MR,Ⅱ型)。MR是高親和力和低容量的糖皮質(zhì)激素受體系統(tǒng),而GR和高容量的糖皮質(zhì)激素受體系統(tǒng)。GR在應(yīng)激后糖皮質(zhì)激素的生理上升期不斷被占領(lǐng)結(jié)合。兩種受體的平衡對(duì)應(yīng)激反應(yīng)和行為學(xué)適應(yīng)發(fā)揮重要的作用。糖皮質(zhì)激素通過(guò)GR,MR介導(dǎo)的兩種反饋模式使HPA軸處于適當(dāng)?shù)乃健Ｔ谶@個(gè)過(guò)程中,可以認(rèn)為皮質(zhì)醇受體起到了一種轉(zhuǎn)錄因子的功能。受體數(shù)量,親和力以及在應(yīng)激反應(yīng)中的功能不同,導(dǎo)致不同個(gè)體血中皮質(zhì)醇激素水平的不同,產(chǎn)生不同的生物學(xué)行為。目前對(duì)PTSD的病人和相關(guān)動(dòng)物模型都觀察到了GR,MR的改變。 細(xì)胞凋亡(apoptosis),又稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death),是由一系列生理和病理刺激引起的。在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中,主要是細(xì)胞色素C從線粒體膜上釋放到了胞漿中,導(dǎo)致Caspases級(jí)聯(lián)放大信號(hào)系統(tǒng)的激活。細(xì)胞色素C進(jìn)入胞漿中,首先活化Caspase-9, Caspase-9再酶解Caspase-3前體,從而活化Caspase-3,最終引起染色體DNA的降解和細(xì)胞的解體。目前已經(jīng)報(bào)道PTSD患者海馬體積減小,以及單一連續(xù)應(yīng)激(single prolonged stress, SPS)導(dǎo)致杏仁核神經(jīng)元的凋亡。Bracha HS對(duì)發(fā)生PTSD的退伍軍人的尸體解剖中發(fā)現(xiàn),藍(lán)斑神經(jīng)元數(shù)目減少,但藍(lán)斑神經(jīng)元數(shù)目減少是否由凋亡引起的呢?PTSD患者藍(lán)斑神經(jīng)元是否存在凋亡,是否導(dǎo)致了藍(lán)斑功能的異常。 實(shí)驗(yàn)方法 1、模型制作及分組 采用2005年日本文部省召開(kāi)的國(guó)際PTSD科學(xué)會(huì)議確定的關(guān)于大鼠PTSD模型-SPS。其具體方法是將大鼠連續(xù)進(jìn)行下述步驟處理：禁錮2 h；強(qiáng)迫性游泳20min(水深40cm,水溫25℃)；休息15min后乙醚麻醉,意識(shí)喪失后停止麻醉；無(wú)干擾常規(guī)喂養(yǎng)直至取材。隨機(jī)分為6組,對(duì)照組、SPS后無(wú)干擾地靜養(yǎng)1d、4d、7d、14d和28d組。 2、藍(lán)斑GR, MR, Caspase-3免疫組織化學(xué)方法 分別選取各組大鼠依次灌流固定、石蠟包埋小腦,制作石蠟切片,分別用SABC法進(jìn)行藍(lán)斑核的GR, MR, Caspase-3免疫組織化學(xué)染色,DAB顯色,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡觀察,攝片。 3、藍(lán)斑Caspase-9免疫熒光染色方法 石蠟切片用PBS漂洗10min×3,5%BSA封閉20min后,滴加鼠單克隆抗體Caspase-9, 0.01mol/L PBS代替一抗作陰性對(duì)照,4℃孵育過(guò)夜,滴加FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG濕盒中37℃孵育30min,甘油封片,熒光顯微鏡觀察并攝片。 4、Western blotting檢測(cè)藍(lán)斑GR, MR 分別取新鮮藍(lán)斑核經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心,提取上清蛋白,電泳,轉(zhuǎn)膜,經(jīng)封閉后分別加一抗4℃過(guò)夜；HRP標(biāo)記1gG孵育2h,EcL發(fā)光,檢測(cè)條帶光密度值。 5、透射電鏡技術(shù)觀察藍(lán)斑神經(jīng)元線粒體COX的表達(dá)變化 切片孵育后用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗,1% OsO4 4℃固定30-60 min,常規(guī)脫水,包埋,經(jīng)半薄切片、超薄切片厚70μm,JEM1200EX透射電鏡下觀察。 6、RT-PCR檢測(cè)藍(lán)斑GR, MR, Caspase-3, Caspase-9和COX 斷頭取腦分離藍(lán)斑核,提取總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳,成像并進(jìn)行積分光密度分析。 結(jié)果 1、藍(lán)斑GR, MR, Caspase-3免疫組織化學(xué)方法染色的結(jié)果 GR分布于神經(jīng)元的胞核,SPS-1d組、SPS-4d組和SPS-7d組與對(duì)照組相比,GR的陽(yáng)性表達(dá)逐漸增強(qiáng),SPS-14d組與SPS-28d組GR的陽(yáng)性表達(dá)下降。MR分布于神經(jīng)元的胞體,SPS-1d組與對(duì)照組相比,MR的陽(yáng)性表達(dá)明顯降低,SPS-4d組、SPS-7d組、SPS-14d組與SPS-28d組MR的陽(yáng)性表達(dá)逐漸增高。 Caspase-3分布于神經(jīng)元的胞體,SPS-1d組、SPS-4d組和SPS-7d組與對(duì)照組相比,Caspases-3的陽(yáng)性表達(dá)逐漸增強(qiáng)；SPS-14d組Caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)下降。 2、藍(lán)斑Caspase-9免疫熒光染色方法結(jié)果 SPS-1d組、SPS-4d組、SPS-7d組和SPS-14d組Caspase-9陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞呈綠色熒光,胞體,胞膜和突起均有著色。 3、Western blotting檢測(cè)藍(lán)斑GR和MR的結(jié)果 GR的分子量87kb,結(jié)果顯示SPS后1d、4d、7d大鼠藍(lán)斑GR的表達(dá)逐漸上調(diào),14d、28d的GR表達(dá)恢復(fù)性下調(diào)。 MR的分子量分別為112kb,結(jié)果顯示SPS后1d大鼠藍(lán)斑M(jìn)R急劇下降,SPS-4d、SPS-7d、SPS-14d和SPS-28d的MR表達(dá)恢復(fù)性上調(diào)。 4、透射電鏡技術(shù)觀察藍(lán)斑核神經(jīng)元線粒體COX的表達(dá)變化的結(jié)果 對(duì)照組藍(lán)斑神經(jīng)元線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)保持良好,陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布在線粒體膜上。SPS刺激后可見(jiàn)線粒體腫脹,空泡變形,嵴斷裂,外膜破裂,COX從線粒體內(nèi)外膜釋放到細(xì)胞漿中。 5、RT-PCR檢測(cè)藍(lán)斑GR, MR, Caspase-3, Caspase-9和COX的結(jié)果 GR在藍(lán)斑內(nèi)表達(dá),以β-actin作為內(nèi)參照,對(duì)各組條帶進(jìn)行分析。與正常對(duì)照組相比,SPS后1d、4d、7d大鼠藍(lán)斑GR的表達(dá)逐漸上調(diào),14d、28d表達(dá)恢復(fù)性下調(diào)。 MR在藍(lán)斑內(nèi)表達(dá),以(3-actin作為內(nèi)參照,對(duì)各組條帶進(jìn)行分析。與正常對(duì)照組相比,SPS后1d藍(lán)斑M(jìn)R急劇下降,SPS-4d、SPS-7d、SPS-14d和SPS-28d組MR表達(dá)恢復(fù)性上調(diào)。 與正常對(duì)照組相比,SPS后1d、4d、7d大鼠藍(lán)斑Caspase-3的表達(dá)逐漸上調(diào),14d恢復(fù)性下調(diào)。COX和Caspase-9于SPS-4d達(dá)到頂峰,SPS-7d組和SPS-14d組表達(dá)逐漸下降。 結(jié)論 1、SPS處理后,藍(lán)斑GR出現(xiàn)短暫上調(diào),隨后下調(diào),揭示PTSD大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元核受體GR的表達(dá)變化可能導(dǎo)致了PTSD的臨床癥狀。 2、PTSD樣大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元MR的表達(dá)變化可能直接參與了PTSD持續(xù)性精神行為障礙的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。 3、藍(lán)斑神經(jīng)元細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致PTSD患者藍(lán)斑功能失調(diào)的重要原因之一。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R749.5
【圖文】：

一、免疫組化結(jié)果1、GR免疫組化結(jié)果高倍鏡觀察GR分布于藍(lán)斑(圖1):免疫組化陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色，對(duì)照組(圖A)GR分布于神經(jīng)元的胞核;SPS一ld組(圖B)、SPS一4d組(圖C)與SPS一7d組(圖D)與對(duì)照組相比，GR的陽(yáng)性表達(dá)逐漸增強(qiáng)，陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量也逐漸增多;SPS一14d組(圖E)與SPS一28d組(圖F)，GR的陽(yáng)性表達(dá)下降，陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量也減少，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。

2、免疫印跡的結(jié)果p一actin和GR的分子量分別為42kb和87kb，結(jié)果顯示SpS后ld、4d、7d大鼠藍(lán)斑GR的表達(dá)逐漸上調(diào)，14d、 28dGR表達(dá)恢復(fù)性下調(diào)(圖2)。IJ-‘、一卿。少““，，如“一網(wǎng)r‘門”一~一州lr引’”----一叫l(wèi)4

★均代表相鄰兩者之間的比較，P<0.05。3、RT一PCR結(jié)果p一actin和GR在藍(lán)斑都表達(dá)，以p一actin作為內(nèi)參照(圖3)，對(duì)各組條帶進(jìn)行分析。與正常對(duì)照組相比，SPS后ld、4d、7d大鼠藍(lán)斑GR的表達(dá)逐漸上調(diào)，14d、28d表達(dá)恢復(fù)性下調(diào)。}…}CDn‘r�！畇PS一“，S一“，s一7‘，s一“‘SPs一28‘}圖3，藍(lán)斑GR的RT一PCR平均灰度值及其分析(爪S)。。、.、▲、.、★均代表相鄰兩者之間的比較

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3 A.Voigt;T.Elgeti;T.Durmus;M.E.Idiz;C.Butler;M.Beling;史曉U

本文編號(hào)：2797638