【摘要】： 前言 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是主要發(fā)生在老年人的一種以進(jìn)行性癡呆為臨床特征的神經(jīng)退行性疾病。隨著人口的逐漸老齡化,AD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān),由于缺乏有效的治療手段,AD已成為危害人類(lèi)健康的主要致死性疾病之一。AD的典型病理特征包括:β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)在腦內(nèi)病理性沉積形成老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)和大腦淀粉樣血管病(cerebral amyloid angiopath,CAA)。Aβ是AD發(fā)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié),體內(nèi)的Aβ由β-淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursor protein,APP)經(jīng)β-和γ-分泌酶水解而成。到目前為止,AD的具體發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚,但越來(lái)越多的證據(jù)表明,鋅離子在AD的發(fā)病和病理過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用。鋅離子能夠通過(guò)鏈接相鄰Aβ分子的第13位上的組氨酸而導(dǎo)致Aβ聚集;與Aβ生成密切相關(guān)的γ-分泌酶為鋅結(jié)合蛋白,細(xì)胞內(nèi)的鋅離子具有抑制γ-分泌酶裂解APP向細(xì)胞外分泌Aβ的作用;口服金屬螯合劑可以明顯抑制APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑的形成。因此,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外金屬離子穩(wěn)態(tài),維持Aβ生成與降解的動(dòng)態(tài)平衡,已經(jīng)成為目前AD治療學(xué)的一個(gè)重要策略。 鋅離子不能自由通過(guò)細(xì)胞膜,特定的轉(zhuǎn)運(yùn)體和膜通道參與鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(zinc transporter,ZnT)是參與腦鋅代謝的重要蛋白家族之一,目前至少擁有7個(gè)成員(ZnT1-7),除ZnT2外均在腦內(nèi)表達(dá),其主要功能是將鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞或聚集在細(xì)胞器內(nèi):ZnT1定位在細(xì)胞膜上,負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的鋅離子向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn);ZnT3定位在突觸小泡膜上,其功能是將鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)并聚集在突觸小泡內(nèi);ZnT4定位在胞質(zhì)小泡膜上,可將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)小泡內(nèi);ZnT5-7定位在高爾基復(fù)合體,參與高爾基復(fù)合體內(nèi)外的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。最新的研究表明,ZnT1,4,6在AD病人大腦內(nèi)的表達(dá)明顯增強(qiáng),而敲除ZnT3基因的APP轉(zhuǎn)基因惺?其腦內(nèi)Aβ老年斑數(shù)量、血管淀粉樣改變均明顯減少,提示ZnT與鋅離子共同參與了AD的發(fā)病和病理過(guò)程。 本研究對(duì)鋅離子和ZnT在AD和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的表達(dá)變化、定位分布及與Aβ的相關(guān)性進(jìn)行系統(tǒng)分析,應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi)技術(shù)探討ZnT1基因沉默阻抑APP轉(zhuǎn)染細(xì)胞Aβ分泌的效果,對(duì)深入探討腦鋅代謝紊亂與AD病理生理機(jī)制具有重要意義。 實(shí)驗(yàn)方法 采用AD病人尸檢腦組織、APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APPsw、APP基因的SH-SY5Y細(xì)胞(APPsw細(xì)胞、APP細(xì)胞)為研究對(duì)象,應(yīng)用浸入式金屬自顯影技術(shù)(autometallography,AMG)檢測(cè)AD病人和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)鋅含量的變化,應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)和激光共聚焦掃描顯微技術(shù)檢測(cè)ZnTs在AD病人和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的定位分布及其與Aβ在老年斑內(nèi)的位置關(guān)系,應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層及海馬內(nèi)ZnTs的表達(dá)變化,應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)(co-immunoprecipitation,co-IP)檢測(cè)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)ZnTs和Aβ的蛋白相關(guān)性,應(yīng)用RNAi技術(shù)阻抑ZnT1基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APPsw、APP基因的SH-SY5Y細(xì)胞的表達(dá),并應(yīng)用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)RNAi對(duì)ZnT1的基因沉默效果,應(yīng)用Zinquin熒光技術(shù)、Western Blot技術(shù)、免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)、ELISA技術(shù)、MTT技術(shù)檢測(cè)ZnT1-RNAi對(duì)細(xì)胞鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)、APP表達(dá)、Aβ分泌和細(xì)胞活力的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、鋅離子在AD病人及APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的分布 AMG結(jié)果顯示,AMG陽(yáng)性的老年斑廣泛分布于AD病人和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)和海馬等腦區(qū),在血管壁及其周?chē)部梢?jiàn)到明顯的呈棕黑色的AMG陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物。AMG陽(yáng)性的老年斑呈圓形或不規(guī)則形,大小不等,在AD病人大腦中多具有明顯的致密核心,而在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)多呈中空狀。 2、ZnTs在AD病人及APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的分布 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,ZnTs免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色,在大腦皮層及海馬內(nèi)均可見(jiàn)ZnTs陽(yáng)性的老年斑分布,斑塊大小不等,形狀為圓形或不規(guī)則形狀,邊界較清晰。高倍鏡下可見(jiàn)ZnT1和ZnT4廣泛分布到整個(gè)老年斑內(nèi),ZnT3、ZnT5及ZnT6主要分布在斑塊周?chē)冃缘纳窠?jīng)元突起內(nèi),而ZnT7則主要表達(dá)于老年斑的中心部位。此外,ZnTs還廣泛表達(dá)于淀粉樣變性的血管壁及其周?chē)?其中以ZnT3染色最深。 免疫熒光雙標(biāo)的共聚焦激光掃描結(jié)果顯示,在AD病人和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi),Aβ免疫陽(yáng)性的老年斑廣泛分布于大腦皮層及海馬的齒狀回、CA1-CA3區(qū)域,幾乎所有Aβ陽(yáng)性的老年斑均有不同程度的ZnTs表達(dá),即ZnTs和Aβ共存于老年斑內(nèi)。高倍鏡觀察可見(jiàn)在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi),Aβ主要分布于老年斑的核心,而不同的ZnTs在老年斑內(nèi)的位置分布存在一定差異(同免疫組織化學(xué)染色結(jié)果),ZnT3免疫熒光除了分布在大腦皮層和海馬的Aβ老年斑中,還可見(jiàn)于海馬苔蘚纖維和淀粉樣變性的血管壁及其周?chē)?3、ZnTs在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層及海馬內(nèi)的表達(dá)變化 Western Blot結(jié)果顯示,ZnTs在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層和海馬內(nèi)的表達(dá)均明顯高于野生型對(duì)照小鼠。其中ZnT1,3,4,5,6,7在大腦皮層的表達(dá)量分別是野生型小鼠的196.6%,201.9%,150.3%,134.2%,162.0%,122.9%;在海馬的表達(dá)量分別是野生型小鼠的280.1%,398.6%,277.1%,168.2%,142.2%,282.3%。 4、ZnTs與Aβ蛋白相關(guān)性分析 Co-IP結(jié)果顯示,應(yīng)用Aβ抗體對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層蛋白進(jìn)行免疫共沉淀,經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳,未見(jiàn)ZnTs條帶。 5、RNAi對(duì)ZnT1基因的沉默效果 RT-PCR結(jié)果顯示,RNAi可在mRNA水平明顯抑制APPsw細(xì)胞的ZnT1表達(dá),干擾后24h即可出現(xiàn)ZnT1的表達(dá)下降,干擾后48h為抑制效果最佳時(shí)間點(diǎn),ZnT1表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的22%。 Western Blot結(jié)果顯示,RNAi可明顯抑制APPsw細(xì)胞的ZnT1蛋白表達(dá),干擾后48h的抑制率達(dá)80%。 6、ZnT1-RNAi對(duì)鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 Zinquin熒光染色結(jié)果顯示,在APPsw細(xì)胞,ZnT1-RNAi后48h,可見(jiàn)鋅離子在細(xì)胞內(nèi)的聚集明顯高于未干擾的對(duì)照組細(xì)胞。 7、ZnT1-RNAi對(duì)APP表達(dá)的影響 Western Blot結(jié)果顯示,RNAi可明顯抑制APPsw、APP細(xì)胞的APP蛋白表達(dá),干擾后48h,APPsw、APP細(xì)胞的APP蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的58%和57%。 免疫熒光雙標(biāo)和熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,RNAi可明顯抑制APPsw細(xì)胞的ZnT1和APP表達(dá),與對(duì)照組相比,二者的免疫熒光均明顯減弱。 8、ZnT1-RNAi對(duì)Aβ分泌量的影響 Elisa結(jié)果顯示,RNAi可明顯抑制APPsw、APP細(xì)胞的Aβ分泌,干擾48h后,APPsw和APP細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)的Aβ含量分別降低49%和37%。 9、鋅離子對(duì)細(xì)胞活力的影響 MTT結(jié)果顯示,正常培養(yǎng)的APPsw、APP和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞(NEO細(xì)胞)活力幾乎沒(méi)有差別;10μM氯化鋅處理可分別降低APPsw、APP細(xì)胞活力19.7%和13.9%,而對(duì)NEO細(xì)胞活力沒(méi)有影響;50μM氯化鋅處理可分別降低APPsw、APP、NEO細(xì)胞活力48.5%、42.7%、30%;100μM氯化鋅處理可分別降低APPsw、APP、NEO細(xì)胞活力66.6%、56.5%、46.1%。 10、ZnT1-RNAi對(duì)細(xì)胞活力的影響 MTT結(jié)果顯示,正常培養(yǎng)條件下,ZnT1-RNAi對(duì)細(xì)胞活力幾乎沒(méi)有影響,在50μM氯化鋅處理的情況下,ZnT1-RNAi可分別提高APPsw、APP細(xì)胞活力14.4%、10.5%。 結(jié)論 1、AD病人和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的老年斑和淀粉樣變性的血管壁及其周?chē)M織富含鋅離子。AMG技術(shù)對(duì)檢測(cè)游離鋅離子具有高度特異性和敏感性,是研究鋅離子在AD病人和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)分布的有利手段。 2、ZnTs與Aβ共表達(dá)于老年斑和淀粉樣變性的血管壁及其周?chē)２煌琙nTs在老年斑內(nèi)的定位分布具有差異性。ZnTs在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層和海馬的表達(dá)均高于野生型小鼠。 3、ZnT1-RNAi可明顯降低穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APPsw,APP基因的SH-SY5Y細(xì)胞的APP表達(dá)和Aβ分泌。 4、ZnT1-RNAi可提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APPsw,APP基因的SH-SY5Y細(xì)胞在高鋅環(huán)境下的細(xì)胞活力。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16
【圖文】：

AMG顯示游離鋅離子在AD病人腦內(nèi)的定位分布二、游離鋅離子在APP用Sl轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的定位分布低倍鏡下觀察AMG染色的APP/PSI轉(zhuǎn)基因小鼠大腦切片，可見(jiàn)呈玫瑰花結(jié)樣的AMG陽(yáng)性老年斑廣泛分布于大腦皮質(zhì)和海馬，斑塊大小不等，呈棕黑色(圖Za)，髓質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)老年斑的分布。在血管及其周?chē)部梢砸?jiàn)到AMG陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物(圖Zb)，提示APP/Psl轉(zhuǎn)基因小鼠的血管淀粉樣病變中同樣存在著鋅離子的聚集高倍鏡下可見(jiàn)，大多數(shù)老年斑中心呈中空狀，球形中心的外周為一層不規(guī)則的深染的花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)，可能為死亡變性的神經(jīng)元突起和細(xì)胞碎片(圖2c)。此外，在嗅球也可見(jiàn)AMG陽(yáng)性反應(yīng)的老年斑(圖3)。通過(guò)AMG染色，嗅球的5層結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，鋅離子主要分布于顆粒層，在小球?qū)訃@嗅小球也可見(jiàn)一些呈點(diǎn)狀分布的鋅離子。AMG陽(yáng)性的老年斑主要分布于含鋅量較高的顆粒層，其

提示 APP/Psl轉(zhuǎn)基因小鼠的血管淀粉樣病變中同樣存在著鋅離子的聚集。高倍鏡下可見(jiàn)，大多數(shù)老年斑中心呈中空狀，球形中心的外周為一層不規(guī)則的深染的花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)，可能為死亡變性的神經(jīng)元突起和細(xì)胞碎片(圖2c)。此外，在嗅球也可見(jiàn)AMG陽(yáng)性反應(yīng)的老年斑(圖3)。通過(guò)AMG染色，嗅球的5層結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，鋅離子主要分布于顆粒層，在小球?qū)訃@嗅小球也可見(jiàn)一些呈點(diǎn)狀分布的鋅離子。AMG陽(yáng)性的老年斑主要分布于含鋅量較高的顆粒層，其它各層僅見(jiàn)散在分布，斑塊大小不等，呈球形或不規(guī)則形(圖3a)。高倍鏡下分析老年斑的結(jié)構(gòu)，大多數(shù)老年斑中央無(wú)AMG陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物，呈中空狀，外周為均勻分布的鋅離子(圖3b

高倍鏡下可見(jiàn)，大多數(shù)老年斑中心呈中空狀，球形中心的外周為一層不規(guī)則的深染的花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)，可能為死亡變性的神經(jīng)元突起和細(xì)胞碎片(圖2c)。此外，在嗅球也可見(jiàn)AMG陽(yáng)性反應(yīng)的老年斑(圖3)。通過(guò)AMG染色，嗅球的5層結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，鋅離子主要分布于顆粒層，在小球?qū)訃@嗅小球也可見(jiàn)一些呈點(diǎn)狀分布的鋅離子。AMG陽(yáng)性的老年斑主要分布于含鋅量較高的顆粒層，其它各層僅見(jiàn)散在分布，斑塊大小不等，呈球形或不規(guī)則形(圖3a)。高倍鏡下分析老年斑的結(jié)構(gòu)，大多數(shù)老年斑中央無(wú)AMG陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物，呈中空狀，外周為均勻分布的鋅離子(圖3b，c

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2796808