【摘要】： 研究背景與目的: 血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是指由腦血管疾病引起的腦組織梗塞、低灌注或出血所致的認知功能損害綜合征。目前,VD已成為老年期癡呆的第二大病因,僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)。隨著人口老齡化和腦血管疾病發(fā)病率的上升,VD的發(fā)病率逐年上升,越來越受到廣泛關(guān)注。但目前對于VD尚無特效治療方法。因此對VD發(fā)病機制和有效防治方法進行研究具有深遠的意義。 神經(jīng)發(fā)生是指神經(jīng)干細胞(neural stem cell,NSC)在一定條件下增殖分化成神經(jīng)元,參與神經(jīng)功能修復(fù)的過程。近年來,NSC研究進展迅速,已證實在成年哺乳動物側(cè)腦室室管膜下區(qū)(the subventricular zone,SVZ)、海馬齒狀回顆粒下區(qū)(the subgranular zone,SGZ)存在內(nèi)源性神經(jīng)干細胞。在一定條件下NSC能夠增殖,并向特定方向分化,但增殖的神經(jīng)細胞不能很好的修復(fù)腦部受損結(jié)構(gòu),對損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)作用也很小。因此,研究內(nèi)源性神經(jīng)干細胞神經(jīng)發(fā)生的過程,并尋找刺激神經(jīng)干細胞增殖分化的方法,將為治療諸如腦血管病、癡呆和植物狀態(tài)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病帶來新的希望。 研究發(fā)現(xiàn),某些神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠促進神經(jīng)干細胞的增殖和分化,在神經(jīng)細胞的發(fā)育和再生過程中發(fā)揮著不可替代的作用。促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)作為一種傳統(tǒng)意義上的造血生長因子,除可誘導(dǎo)紅系祖細胞增殖分化來治療貧血以外,還有著造血作用以外的重要生物學作用。EPO產(chǎn)生和分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),具有內(nèi)源性神經(jīng)保護作用,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧狀態(tài)下可檢測到EPO的分泌增多,并證實EPO的分泌是腦組織對缺血缺氧的保護機制:EPO治療可以改善實驗動物和腎衰竭透析病人的認知功能。并且EPO在一定條件下能促進神經(jīng)干細胞生長及存活。然而,迄今為止有關(guān)EPO治療對VD大鼠認知功能影響及神經(jīng)發(fā)生的研究甚少。為此,本文建立了VD動物模型,從行為學和組織形態(tài)學方面探討EPO治療對VD大鼠神經(jīng)發(fā)生和認知功能的影響。本實驗采用穿梭箱檢測大鼠認知功能、采用免疫組織化學法觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞增殖分化情況、采用western-blot方法檢測細胞因子BDNF、VEGF蛋白表達情況,探討EPO治療后對VD大鼠神經(jīng)發(fā)生及認知功能改善的機制,為臨床血管性癡呆的治療提供新的方法和思路。 材料與方法 第一部分:EPO對血管性癡呆大鼠認知功能及細胞因子分泌的影響 1. EPO對VD大鼠認識功能的影響實驗動物選取清潔級SD大鼠45只。隨機分為三組:對照組、VD組和治療組。造模后治療組大鼠腹腔內(nèi)注射rhEPO(5000IU/kg),每天1次,連續(xù)7天。其余兩組給予等量生理鹽水腹腔注射。各組大鼠均采用穿梭箱系統(tǒng)進行訓練。本實驗中大鼠的學習記憶能力以完成主動回避反應(yīng)的次數(shù)與測試總次數(shù)(20次)的比值為代表,即主動回避反應(yīng)率(Active avoidance reaction ratio,AAR ratio)。于造模前、造模后1周、2周和4周各時相點行穿梭箱檢測。 2. EPO對VD大鼠BDNF、VEGF表達的影響 實驗動物選取清潔級SD大鼠15只,隨機分為三組:對照組、VD組和治療組(n=5)。造模后治療組腹腔內(nèi)注射rhEPO(5000IU/kg,每天1次,連續(xù)7天)。其余兩組給予等量生理鹽水腹腔注射。于造模后2周使用western blot方法檢測大鼠海馬BDNF、VEGF表達的變化。 第二部分:EPO對血管性癡呆大鼠神經(jīng)發(fā)生的影響 1. EPO對VD大鼠神經(jīng)干細胞增殖的影響 實驗動物選取清潔級SD大鼠45只。隨機分為三組:對照組、VD組和治療組。每組取造模后1周、2周和4周3個時相點(n=5)。采用5-溴-2-脫氧尿苷(5-Bromo-2-deoxyuridine,BrdU)標記法(50mg/kg體重,腹腔注射,每天2次,連續(xù)7天)標記處于有絲分裂S期細胞。治療組給予腹腔內(nèi)注射rhEPO(5000IU/kg,每天1次,連續(xù)7天)。免疫組化法檢測BrdU表達水平,進行細胞計數(shù),檢測EPO對VD大鼠海馬細胞增殖的影響。 2. EPO對VD大鼠神經(jīng)干細胞分化的影響 實驗動物選取清潔級SD大鼠45只。隨機分為三組:對照組、VD組和治療組。每組取造模后1周、2周和4周3個時相點(n=5)。采用5-溴-2-脫氧尿苷(5-Bromo -2-deoxyuridine,BrdU)標記法標記處于有絲分裂S期細胞,治療組給予腹腔內(nèi)注射rhEPO。免疫熒光雙標法法檢測BrdU陽性細胞類型,采用BrdU/DCX、BrdU/NSE雙標法分別標記BrdU陽性細胞中未分化成熟及分化成熟的神經(jīng)元的比例。 結(jié)果 一、EPO對VD大鼠認識功能的影響 穿梭箱結(jié)果顯示造模前各組大鼠AAR比率無明顯差異。造模后VD組大鼠AAR比率顯著低于對照組;治療組大鼠AAR比率顯著低于對照組,但高于VD組,且隨著造模后時間的推移逐漸升高。提示EPO對VD大鼠的認知功能缺失有改善作用。 二、EPO對VD大鼠BDNF、VEGF表達的影響 造模后2w大鼠腦標本免疫印跡結(jié)果顯示,VD組和對照組BDNF、VEGF含量無明顯差別,而治療組BDNF、VEGF含量較VD組及對照組明顯增加。提示EPO有促進VD大鼠腦內(nèi)細胞因子BDNF、VEGF表達的作用。 三、EPO對VD大鼠海馬區(qū)細胞增殖的影響 免疫組化結(jié)果顯示造模后1周,BrdU標記陽性細胞主要分布于海馬顆粒下層,形狀不規(guī)則,緊密排列,成簇出現(xiàn)。VD組BrdU標記陽性細胞數(shù)明顯多于對照組,治療組BrdU標記陽性細胞數(shù)明顯高于VD組;造模后4周,對照組大鼠BrdU標記陽性細胞無明顯變化。VD組和治療組BrdU標記陽性細胞主要分布在顆粒下層和顆粒層,兩組BrdU標記陽性細胞數(shù)量均較前明顯下降。VD組BrdU標記陽性細胞數(shù)量下降更為明顯,與對照組無明顯差異,治療組BrdU標記陽性細胞數(shù)量下降幅度最小,BrdU標記陽性細胞數(shù)量明顯多于其余兩組。 四、EPO對VD大鼠海馬區(qū)細胞分化的影響 免疫熒光雙標對BrdU標記陽性細胞進行鑒定,發(fā)現(xiàn)造模后1周,治療組BrdU/DCX免疫熒光雙標陽性細胞數(shù)明顯高于VD組,各組間BrdU/DCX雙陽性細胞百分比比較無明顯差異;造模后4周,治療組大鼠BrdU/NSE免疫熒光雙標陽性細胞數(shù)明顯高于VD組,各組間BrdU/NSE雙陽性細胞百分比比較無明顯差異。 結(jié)論 1、行為學結(jié)果顯示VD大鼠認知功能明顯降低;給予EPO治療后VD大鼠認識功能得到顯著改善; 2、VD大鼠腦內(nèi)BDNF、VEGF蛋白表達與對照組沒有明顯差異;給予EPO治療后,VD大鼠腦內(nèi)BDNF、VEGF蛋白表達明顯增加; 3、免疫組化及免疫熒光檢測證實,EPO可以促進VD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞增殖,但對其分化影響不明顯。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R749.13

【參考文獻】

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1 臧大維;劉娟;左憲華;Surindar Cheema;;腦源性神經(jīng)生長因子促進腦梗死后小鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖及向神經(jīng)元分化[J];中國臨床康復(fù);2006年33期

2 周宏;彭好;熊英;;神經(jīng)生長因子對新生鼠缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)修復(fù)作用的研究[J];中國新生兒科雜志;2007年02期

3 王蕊,楊秦飛,唐一鵬,房良敏,胡京紅,賈緒東,洪慶濤;大鼠擬“血管性癡呆”模型的改進[J];中國病理生理雜志;2000年10期

4 趙延欣,呂傳真,羅玉敏;rhG-CSF增加腦缺血周邊區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達[J];中國神經(jīng)科學雜志;2004年04期

本文編號：2783363