【摘要】：背景和目的 隨著人口老齡化的發(fā)展和腦血管病患病率的升高,血管性癡呆(VascularDementia,VD)的發(fā)病也不斷上升。張振馨等人的研究顯示,我國年齡≥65歲者,調(diào)整抽樣誤差后血管性癡呆總患病粗率為1.1%。因此,探索血管性癡呆發(fā)生的危險(xiǎn)因素,早期診斷方法和防治措施,已經(jīng)成為當(dāng)前我國臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的重要課題。 研究發(fā)現(xiàn),興奮性氨基酸毒性和細(xì)胞凋亡參與了血管性癡呆的病理過程。在腦內(nèi)興奮性氨基酸主要是谷氨酸和甘氨酸,谷氨酸含量最多,分布最廣。谷氨酸受體分為離子型和代謝型兩大類,離子型受體又分為NMDA受體,AMPA受體,KA受體。缺血缺氧將導(dǎo)致NMDA受體的過度激活,引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載,激活一氧化氮合酶,產(chǎn)生過量一氧化氮,產(chǎn)生細(xì)胞毒性;胞內(nèi)鈣離子超載,使線粒體去極化,細(xì)胞色素C釋放,激活Caspase家族,引起細(xì)胞凋亡。 鹽酸美金剛為中等親和力,非競爭性,電壓依賴性NMDA受體阻斷劑,能夠阻斷NMDA受體過度開放導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載,減少鈣離子超載繼發(fā)引起的細(xì)胞凋亡,明顯減輕興奮性氨基酸毒性,對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎法建立血管性癡呆的大鼠模型,用Y型迷宮評價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,HE染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變,免疫組化法檢測大鼠海馬神經(jīng)元中的nNOS和Caspase-3的表達(dá),TUNEL法檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡情況,探討鹽酸美金剛對血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制。 材料與方法 1動物及分組健康雄性Wistar大鼠36只(河南省醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供),16月≤月齡≤18月,質(zhì)量(400±50)g,隨機(jī)分為假手術(shù)組、血管性癡呆組和鹽酸美金剛治療組,每組12只。 2模型制備及藥物干預(yù)采用雙側(cè)頸總動脈(CCA)永久結(jié)扎法制備模型,鹽酸美金剛組給予鹽酸美金剛3mg/kg(溶解于生理鹽水中)灌胃,每同1次,共6w;假手術(shù)組和血管性癡呆組給予生理鹽水1ml灌胃,每日1次,共6w。 3學(xué)習(xí)記憶能力測定灌胃結(jié)束后用Y-型迷宮測試學(xué)習(xí)能力,以連續(xù)10次測試中有9次正確反應(yīng)即為達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn),記錄動物達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)所需電擊的次數(shù),以此作為學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。24 h后,重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)過程,觀察大鼠的記憶能力。 4標(biāo)本制備行為學(xué)測試完畢后,將大鼠麻醉,經(jīng)心臟灌注內(nèi)固定取腦,在鼠腦最寬部位(海馬冠狀位)取3mm,多聚甲醛固定,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋,連續(xù)冠狀切片,片厚約5μm,HE染色觀察形態(tài)學(xué)變化,采用SP免疫組化法檢測nNOS和Caspase-3,采用TUNEL法測定凋亡細(xì)胞。 5免疫組化及TUNEL染色的結(jié)果判定免疫陽性細(xì)胞被染成棕黃色,nNOS和Caspase-3都是胞漿著色,采用Qwin550CW圖像處理與分析系統(tǒng),測定陽性反應(yīng)物質(zhì)的平均積分光密度值。TUNEL染色時(shí)凋亡細(xì)胞為胞核著色,呈棕黃色,統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞的數(shù)量,以百分比為統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)。 6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SSPS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,采用單因素方差分析法,用S-N-K法進(jìn)行組間的兩兩比較。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果 1學(xué)習(xí)記憶成績血管性癡呆組大鼠達(dá)標(biāo)時(shí)所需電擊次數(shù)最多(學(xué)習(xí)成績79.25±2.01次,記憶成績69.17±1.70次),鹽酸美金剛組居中(學(xué)習(xí)成績63.16±1.75次,記憶成績53.17±1.85次),而假手術(shù)組最少(學(xué)習(xí)成績50.83±1.80次,記憶成績40.67±1.83次),三組間的成績有顯著性差異,P＜0.01。 2海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)比較HE染色后在400倍光鏡下觀察到:假手術(shù)組神經(jīng)元數(shù)量很多,排列緊密、均勻整齊,胞核呈圓形或橢圓形,核仁明顯,染色質(zhì)均勻;血管性癡呆組神經(jīng)元數(shù)目較少,排列紊亂,胞核深染,固縮,核仁消失,胞漿周圍發(fā)現(xiàn)空暈,胞間距較大;鹽酸美金剛組正常神經(jīng)元數(shù)量較多,排列較密,胞核呈圓形或橢圓形,核仁清晰,染色質(zhì)豐富,可見少量固縮變性的神經(jīng)元。 3免疫組化結(jié)果光鏡下觀察nNOS,Caspase-3陽性細(xì)胞呈胞漿棕褐色細(xì)顆粒狀著色。假手術(shù)組有極少量弱染及中等強(qiáng)度染色的nNOS陽性神經(jīng)元;血管性癡呆組nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量大量增加,染色較深;鹽酸美金剛組見少量弱染及中等強(qiáng)度染色的nNOS陽性神經(jīng)元,數(shù)量較血管性癡呆組明顯減少;nNOS的平均積分光密度值依次為:105.63±3.52,175.87±3.34,140.23±2.30,F=1539.67,p＜0.01;Caspase-3的染色結(jié)果與nNOS相似,Caspase-3平均積分光密度值依次為:99.54±5.06,162.78±5.25,132.78±5.36,F=439.37,p＜0.01,三組間的陽性區(qū)平均積分光密度值有顯著性差異。 4細(xì)胞凋亡假手術(shù)組只有零星的凋亡細(xì)胞,血管性癡呆組見大量凋亡細(xì)胞,鹽酸美金剛組凋亡細(xì)胞較血管性癡呆組明顯減少,三組間的凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比有顯著性差異(依次為6.33±3.65,56.17±3.56,33.75±2.70,F=672.91,p＜0.01)。 結(jié)論 1細(xì)胞凋亡參與了血管性癡呆的病理生理過程,而Caspase-3和nNOS可能是引起細(xì)胞凋亡的重要蛋白酶。 2鹽酸美金剛能夠減輕血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元的損傷,提高其學(xué)習(xí)記憶能力,其機(jī)制可能是通過抑制血管性癡呆大鼠nNOS和Caspase-3的過度表達(dá),有效減少細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R749.161
【圖文】：

1各組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績血管性癡呆組大鼠達(dá)標(biāo)時(shí)所需電擊次數(shù)最多，鹽酸美金剛組居中，而假手術(shù)組最少，三組間的成績有顯著性差異(P<0.01)(見表1，圖1)。表1各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶時(shí)達(dá)標(biāo)電擊次數(shù)組別n學(xué)習(xí)時(shí)達(dá)標(biāo)電擊次數(shù)記憶時(shí)達(dá)標(biāo)電擊次數(shù)假手術(shù)組 1250.83士 1.8040.67土1.83血管性癡呆組 1279.25士 2.0169.17士1.70鹽酸美金剛組 1263.16士 l.75ab53.17士1.55曲 F707.91762.43 P0.0()00.O00注:鹽酸美金剛組與假手術(shù)組比較尸<0.01，與血管性癡呆組比較戶<0.01。90.0080.0070.0060.0050.0040.0030.0020.0010.000.00假手術(shù)組鹽酸美金剛組血管性癡呆組圖1各組大鼠學(xué)習(xí)記憶時(shí)達(dá)標(biāo)電擊次數(shù)2各組大鼠海馬CAI區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)比較HE染色后在400倍光鏡下觀察到:假手術(shù)組神經(jīng)元數(shù)量多，排列緊密，均勻，整齊，胞核呈圓形或橢圓形，核仁明顯，染色質(zhì)均勻;血管性癡呆組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)松散，數(shù)目減少，排列紊亂，胞核深染，固縮，核仁消失，胞漿周圍發(fā)現(xiàn)空

染的陽性細(xì)胞突起構(gòu)成;鹽酸美金剛組僅見少量弱染及中等強(qiáng)度染色的nNOS陽性神經(jīng)元，數(shù)量明顯減少。casPase一3的染色結(jié)果與nNOs一相似。三組間的陽性區(qū)平均積分光密度值有顯著性差異，P<0.01(見表2，圖2，附圖小9)。表2各組大鼠海馬CAI區(qū)陽性區(qū)平均積分光密度值組別 nnNOSCasPase一3假手術(shù)組 12105.63士3.52卯.54士5.腸血管性癡呆組 12175.57士 3.34162.78士5.25鹽酸美金剛組12一40.23士2.30曲一32.75士s.36ab F1539.67439.37 P0.0()00.lX用注:鹽酸美金剛組與假手術(shù)組比較尸<0.01，與血管性癡呆組比較戶<0.01。200

本文編號：2779803