【摘要】：研究目的1.解析Gαi介導(dǎo)MANF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制;2.明確小鼠海馬區(qū)Gαi1/3表達(dá)水平和焦慮行為的相關(guān)性。研究方法培養(yǎng)野生型(WT),Gαi1/3雙敲除型(DKO),Gαi1單敲型,Gαi3單敲型,Gαi2單敲型的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)以及Gab1敲除的MEFs細(xì)胞;運(yùn)用shRNA方法在MEFs中靶向敲減Gαi1和/或Gαi3;在DKO MEFs細(xì)胞中重新導(dǎo)入Gαi1和Gαi3的表達(dá)質(zhì)粒,獲得Resure1和Resure3 MEFs;分別用MANF對(duì)上述MEFs細(xì)胞進(jìn)行處理,檢測(cè)細(xì)胞中下游接頭蛋白Gab1以及 AKT-mTORC1 信號(hào)通路(Akt,S6,S6K,GSK3α/3β)和 MAPK/ERK 信號(hào)通路(Erk)的活化水平;利用shRNA慢病毒干擾技術(shù),通過小鼠腦立體定位方法,在SPF級(jí)ICR雄性小鼠海馬區(qū)注射干擾病毒,檢測(cè)小鼠焦慮樣行為的變化。結(jié)果MEFs 中,Gαi1/3 雙敲(DKO)阻斷了 MANF 誘導(dǎo)的 AKT-mTOR/ERK-MAPK信號(hào)通路的活化;Gαi-shRNA、Gαi1-KO、Gαi3-KO 的 MEFs 在 MANF 刺激后,下游信號(hào)都有輕微減弱,Gαi2-KO的MEFs在MANF處理后,下游信號(hào)沒有顯著變化;Resure1和Resure3 MEFs,在MANF刺激后,下游信號(hào)活化有明顯的恢復(fù);Gab1敲除的MEFs,在MANF刺激后,表現(xiàn)出下游AKT-mTORC1信號(hào)通路(AktSer473,S6,S6K)和MAPK/ERK信號(hào)通路(Erk)活化水平的大幅度降低甚至缺失;小鼠海馬區(qū)注射Gαi1/3-shRNA慢病毒后,焦慮樣行為顯著增加;小鼠海馬區(qū)注射慢病毒包裹的Gαi1/3突變質(zhì)粒(DN),焦慮樣行為增加,但沒有明顯的認(rèn)知障礙,而注射持續(xù)活化的Gαi1/3(CA),小鼠沒有表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為。結(jié)論1.體外結(jié)果提示Gαi1/3可能介導(dǎo)MANF誘導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);2.行為學(xué)結(jié)果表明海馬區(qū)Gαi1/3可能參與調(diào)控小鼠焦慮樣行為。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R749.72
【圖文】：

逡逑ａ，ｂ：指定濃度的ＭＡＮＦ處理ＷＴ和Ｇｏｄｌ＋３－ＤＫＯＭＥＦｓ指定時(shí)間，ｃ，ｄ：不同逡逑濃度的ＭＡＮＦ處理ＷＴ和Ｇａｉ－ｌ＋３－ＤＫＯ邋ＭＥＦｓ指定時(shí)間，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測(cè)上述蛋白逡逑的表達(dá)；＊＊＊／＞＜Ｏ．Ｏｌｖｓ．ＷＴ。逡逑２０逡逑

游ＡＫＴ／ｍＴＯＲＣｌ信號(hào)通路中的標(biāo)志性蛋白（Ａｋｔ，Ｓ６，Ｓ６Ｋ，ＧＳＫ３ａ，ＧＳＫ３ｐ）磷逡逑酸化水平嚴(yán)重降低甚至缺失，ＭＡＰＫ／ＥＲＫ信號(hào)通路中的標(biāo)志性蛋白（Ｅｒｋ）的磷酸化逡逑水平也嚴(yán)重降低甚至缺失（圖２）。逡逑１９逡逑

（５０ｎｇ／ｍｌ）處理不同時(shí)長（分別為對(duì)照、７ｍｉｎ、１５ｍｉｎ）后，用裂解液提取細(xì)胞蛋白，逡逑用邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ邋方法檢測(cè)不同處理情況下，ＡＫＴ／ｍＴＯＲＣｌ邋（Ａｋｔ，Ｓ６，邋ＧＳＫ３ａ，邋ＧＳＫ３ｐ）逡逑和ＭＡＰＫ／ＥＲＫ邋（Ｅｒｋ）信號(hào)通路表達(dá)差異，結(jié)果顯示（圖５）：與ＷＴＭＥＦｓ細(xì)胞相比，逡逑ｓｈＲＮＡＭＥＦｓ邋細(xì)胞中

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5 劉U

本文編號(hào)：2779618