【摘要】：前言與背景國內外大量的雙生子研究、寄養(yǎng)子研究證實,精神分裂癥(Schizophrenia)具有非常明顯的遺傳傾向,是一種典型的多基因遺傳病。Cannon等人在芬蘭人群中的研究顯示,精神分裂癥的遺傳度(heritability)高達83%,國內王為民等人在中國漢族人中進行的調查得到精神分裂癥的遺傳度為70.85%。說明精神分裂癥的易患性中遺傳基礎所起的作用超過70%,而環(huán)境因素所起的作用不足30%。通過復合分離分析,連鎖分析,受累同胞對分析,基于單核苷酸多態(tài)性(SNP)的關聯(lián)分析以及全基因組關聯(lián)分析(GWAS)等研究方法的應用,大量的精神分裂癥易感位點(lq21-22、6p22-24、8p21-22、13q14-32等)和易感基因(DISC1、 COMT、BDNF、PLXNA2、CSF2R、PCM1、ZNF804A、RELN等)被發(fā)現(xiàn)。精神分裂癥斷裂基因1(DISCI)是目前較明確的精神分裂癥易感基因之一,其首次在一個具有染色體平衡易位的蘇格蘭精神疾病高發(fā)家系中被發(fā)現(xiàn),后續(xù)的深入研究顯示DISCI與精神分裂癥存在顯著的相關性。酵母雙雜交分析顯示,DISCI蛋白是一個腳手架蛋白(scaffold protein),可與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關鍵蛋白(PDE4B, GSK-3β,FEZ1, NDEL1, PCM1, GRB2, NDE1, ATF5, YWHAE等)發(fā)生相互作用。DISC1蛋白和大量與其相互作用的蛋白質共同組成的相互作用組(interactome)被稱為DISC1通路(DISC1 pathway)。Bradshaw等人的研究顯示,DISCI與DISCI通路中多種DISCI相互作用蛋白質是精神分裂癥等多種精神疾病的可能分子發(fā)生機制。NDEL1和PCM1作為兩種重要的DISCI通路蛋白,其與精神分裂癥的相關性也得到國內外大量研究的證實。Lipska等對精神分裂癥患者尸檢結果顯示精神分裂癥患者海馬和背外側前額葉皮層中NDEL1的表達較正常對照顯著降低。Tomppo等在芬蘭人群中進行的病例對照研究發(fā)現(xiàn)NDEL1基因中一個SNP位點rs17806986與精神分裂癥顯著相關。同年,Ikeda等在日本人群中的研究發(fā)現(xiàn)NDEL1基因的兩個SNP:rs3744652、rs8064655與精神分裂癥不相關。最新的研究發(fā)現(xiàn),精神分裂癥患者血漿NDEL1寡肽酶活性顯著低于健康人群,提示血漿NDEL1寡肽酶活性有可能成為精神分裂癥的生物標志物用于其輔助診斷。Datta等發(fā)現(xiàn),英格蘭人群中PCM1基因中的SNP位點rs208747、rs445422、rsl3276297、rs370429與精神分裂癥顯著相關。而Hashimoto等在日本人群的研究表明rs445422、rs3780103、rs3214087、rs370429的基因型頻率及等位基因頻率在精神分裂癥和正常對照間無顯著性差異。上述文獻顯示,NDEL1基因和PCM1基因與精神分裂癥在歐洲人群中存在關聯(lián),但這種關聯(lián)并未在中國漢族人群中進行重復研究,而且兩個基因與精神分裂癥的關聯(lián)在日本人群中均未得到重復,究其原因有三種可能：首先,真的假陽性關聯(lián)正確的沒有被重復；其次,真的關聯(lián)在后續(xù)檢驗效能較低的重復研究中沒有被重復；最后,真的關聯(lián)在其研究人群中存在,由于復雜疾病的遺傳異質性,在不同人群中進行的重復研究未能重復此關聯(lián)。重復研究是確保發(fā)現(xiàn)與疾病真關聯(lián)的必要保證,為了進一步闡明NDEL1基因、PCM1基因與精神分裂癥之間的相關性特別是其與中國漢族人精神分裂癥的相關性,本研究首次使用病例對照研究對中國南方漢族人群NDEL1基因和PCM1基因多態(tài)性與精神分裂癥相關性進行研究。目的1在中國南方漢族人中重復和驗證NDEL1基因rs17806986位點以及PCM1基因rsl3276297, rs208747位點多態(tài)性與精神分裂癥的相關性；2探討NDEL1、PCM1基因多個標簽SNP位點多態(tài)性與精神分裂癥的相關性,進一步闡明中國南方漢族人中NDEL1基因和PCMl基因多態(tài)性與精神分裂癥的相關性；3探討與精神分裂癥相關聯(lián)的SNP位點多態(tài)性與精神分裂癥患者的首次發(fā)病年齡、住院次數(shù)、有無家族史、精神分裂癥臨床分型等臨床特征的相關性,比較不同基因型上述臨床特征間是否存在統(tǒng)計學差異。對象和方法1隨機選擇2013年6月-2014年6月期間在深圳市康寧醫(yī)院急性干預科男病區(qū),急性干預科女病區(qū),普通精神科男病區(qū),普通精神科女病區(qū)住院的精神分裂癥患者100例,其中男性53例,女性47例,平均年齡32.72±10.14歲。隨機選擇2014年5月-2014年6月期間在深圳市龍崗中心醫(yī)院體檢科進行健康體檢的健康體檢者50名作為正常對照組,其中男性28名,女性22名,平均年齡32.24±8.73歲。病例組要求：由兩名主治職稱或以上的精神科醫(yī)生依據(jù)DSM-Ⅳ做出精神分裂癥的診斷；患者的生物學父親、母親均為漢族人：患者年齡要求18-60歲,男女性別不做限制；患者本人或者患者家屬或其他法定監(jiān)護人對本研究內容和性質充分了解并簽署了知情同意書。排除心境障礙、精神發(fā)育遲緩、分裂情感性精神障礙等其他認知障礙及有嚴重軀體疾病者。正常對照組要求：受試者生物學父親、母親均為漢族人；受試者年齡要求18-60歲,男女性別不做限制：性別、年齡等一般人口學資料與病例組匹配；受試者與病例組無親緣關系；受試者對本研究內容和性質充分了解并簽署了知情同意書。排除具有神經(jīng)精神疾病史,具有精神分裂癥家族史或患有嚴重的軀體疾病或精神系統(tǒng)疾病者。2基因多態(tài)性檢測(1)標簽SNP選擇：在國際人類基因組單倍型圖計劃網(wǎng)站(http://hapmap.ncbi. nlm.nih.gov/)檢索NDEL1基因和PCM1基因內部及上游和下游各lOkb的中國北京漢族人群(CHB)的基因型數(shù)據(jù)包(Release28, Phase Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)。使用Haploview 4.2軟件分別對下載的NDEL1基因和PCM1基因SNP數(shù)據(jù)包進行分析并篩選出標簽SNP (TagSNP)。(2)基因組DNA的制備：每一個研究對象使用EDTA-2K真空采血管經(jīng)肘靜脈采集靜脈血3ml,輕輕上下顛倒混勻。使用北京百泰克生物技術有限公司的全血基因組DNA快速提取試劑盒(溶液型)提取樣本中所含的基因組DNA。使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取DNA純度,使用核酸蛋白分析儀測定所提取DNA樣本的濃度和純度。(3)基因型檢測：使用Sequenom公司推出的基因分析工具MassARRAY(?)分子量陣列技術進行各SNP位點的基因型檢測。該技術通過將引物延伸,切割反應與靈敏、可靠的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS)技術相結合實現(xiàn)基因分型檢測。首先通過PCR擴增出含有SNP位點的一段DNA(SNP位點前后各50bp左右),然后用蝦堿性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase, SAP)去除掉PCR體系中剩余的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物,然后加入一單堿基延伸引物,其3’末端堿基緊挨SNP位點,采用四種2’,3’-雙脫氧核苷酸(Dideoxynucleotide, ddNTP)替代dNTP。這樣,探針在SNP位點處僅延伸一個堿基,連接上的ddNTP與SNP位點的等位基因對應。最后用MALDI-TOF MS檢測延伸產(chǎn)物與未延伸引物間的分子量差異以確定該點處堿基,進而確定該SNP位點的基因型。(4)統(tǒng)計學處理：病例組、對照組間年齡比較在SPSS17.0軟件上使用獨立樣本t檢驗,病例組、對照組間性別分布比較在SPSS17.0軟件上使用χ2檢驗。在SPSS17.0軟件上使用擬合優(yōu)度χ2檢驗對對照組各SNP位點進行哈迪溫伯格平衡檢驗,以P0.05作為群體SNP位點分布符合哈迪溫伯格平衡的標準。在SPSS17.0軟件上使用χ2檢驗對病例組、對照組間單個SNP位點等位基因頻率差異進行比較。在SNPstats在線軟件上(http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats)使用非條件Logistic回歸分析在五種不同遺傳模式下(共顯性遺傳、顯性遺傳、隱形遺傳、超顯性遺傳、加性遺傳)分析各個SNP位點與精神分裂癥的相關性。針對本研究存在的多重檢驗問題,采用錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate, FDR)標準下的BH(Benjamini-Hochberg)法進行多重校正。使用Haploview 4.2軟件分析同一個基因不同SNP位點間的連鎖不平衡。在Haploview 4.2軟件上進行單倍型塊設定,并在病例組、對照組間比較單倍型塊中不同單倍型做與精神分裂癥的相關性。精神分裂癥患者同一個SNP位點不同基因型之間臨床特征的比較使用SPSS17.0軟件,分類變量選擇χ2檢驗；連續(xù)變量若數(shù)據(jù)分布符合正態(tài)分布選擇單向方差分析,數(shù)據(jù)分布不符合正態(tài)分布則選擇Kruskal-Wallis H多組秩和檢驗。結果1 NDEL1基因SNP位點多態(tài)性與精神分裂癥的關聯(lián)分析：(1)等位基因頻率與精神分裂癥的關聯(lián)分析：對所選5個NDEL1基因SNP位點的等位基因頻率進行病例對照分析,結果顯示各SNP等位基因頻率在病例組和對照組間無顯著性差異。病例組和對照組性別分層后,對男性群體和女性群體分別進行等位基因頻率病例對照分析,結果顯示各SNP等位基因頻率在不同性別病例、對照人群中均無顯著性差異。(2)基因型分布與精神分裂癥的關聯(lián)分析：挑選每個SNP位點AIC和BIC數(shù)值最小的遺傳模型為該SNP可能的遺傳模型,對此遺傳模型對應的P值采用基于FDR的BH法進行校正,得到FDR校正P值PFDR。結果顯示校正后rs17806986基因型分布在超顯性遺傳模式下仍與精神分裂癥存在顯著相關(PFDR=.027, OR=2.96,95% CI:1.42-6.17),說明G/C基因型可顯著增加精神分裂癥的患病風險,該位點基因型為G/C的攜帶者患精神分裂癥的風險是基因型為G/G和C/C的攜帶者的2.96倍。其余SNP位點校正后與精神分裂癥均無顯著相關性。將病例組和對照組進行性別分層后,對男性群體和女性群體分別分析rs17806986位點基因型分布與精神分裂癥的相關性。結果顯示,男性人群中rs17806986位點基因型分布在超顯性遺傳模式與精神分裂癥顯著相關(P=0.015,基因型G/C相對于G/G和C/C,oR=3.26,95%CI:1.22-8.72).說明在男性人群中rs17806986基因型G/C的攜帶者患精神分裂癥的風險是基因型為G/G和C/C的3.26倍。女性人群中,rs17806986基因型分布與精神分裂癥無相關性。(3)連鎖不平衡檢驗及單倍型關聯(lián)分析：5個SNP中,rs17806986與其余四個SNP間r2均小于0.33,提示rs17806986與其余四個SNP間LD程度非常弱,rs8065812, rs1391766, rs8064655, rs931672彼此間r2均接近1,提示這四個SNP之間幾乎完全連鎖。rs8065812, rs1391766, rs8064655, rs931672等4個SNP構成一個單倍型塊,主要由CGCC和TCTT兩個單倍型構成,在總人群及男性,女性人群中,兩個單倍型CGCC和TCTT與精神分裂癥均無顯著相關性。(4)精神分裂癥患者rs17806986位點不同基因型臨床特征比較：CC, CG, GG三種基因型的精神分裂癥患者的首發(fā)年齡、住院次數(shù)、家族史及臨床分型均無顯著性差異。2 PCM1基因SNP位點多態(tài)性與精神分裂癥的關聯(lián)分析：(1)等位基因頻率與精神分裂癥的關聯(lián)分析：對從PCM1基因中選取的5個SNP位點的等位基因頻率進行病例對照分析,結果顯示各SNP位點等位基因頻率在病例組和對照組間均無顯著性差異。將病例組和對照組按照不同性別進行分層后,對男性群體和女性群體分別進行等位基因頻率病例對照分析,結果顯示各SNP等位基因頻率在不同性別病例、對照人群中均無顯著性差異。(2)基因型分布與精神分裂癥的關聯(lián)分析：rs2285310, rs208062, rs208022, rs208756位點在5種不同的遺傳模式下與精神分裂均無顯著性相關。rs13276297位點由于僅檢測C/C, T/C兩種基因型,未檢測到T/T基因型,無法按照上述5種遺傳模式進行分析,故直接使用非條件Logistic回歸方法(SNPstats軟件)對其兩種基因型進行分析。結果顯示rs13276297基因型分布與精神分裂無顯著性相關。將病例組和對照組按照不同性別進行性別分層后,分別分析男性人群和女性人群SNP位點基因型分布與精神分裂癥的相關性,結果顯示不同性別人群中5個SNP位點的基因型分布在5種遺傳模式下與精神分裂癥均不存在顯著性關聯(lián)。(3)連鎖不平衡檢驗及單倍型關聯(lián)分析：5個SNP中rs208756-rs2285310(r2=0.71),rs208756-rs208022 (r2=0.56), rs208022-rs2285310 (r2=0.37)呈強連鎖不平衡,其他SNP位點間不存在或僅存在較弱的連鎖不平衡。5個SNP間未構成任何單倍型塊,無法進行單倍型病例對照分析。結論(1) NDEL1基因可能是中國南方漢族人精神分裂癥的易感基因之一,其位于1號內含子的rs17806986位點的基因型分布與精神分裂癥存在顯著關聯(lián),G/C基因型使精神分裂癥患病風險增加2.96倍,且這種相關性僅見于與男性人群,女性人群中無此相關性。精神分裂癥患者rs17806986位點不同基因型之間性別、首次發(fā)病年齡、住院次數(shù)、有無家族史、精神分裂癥臨床分型等臨床特征均無顯著性差異。(2)歐洲人群中PCM1基因內與精神分裂癥顯著關聯(lián)的SNP位點rsl3276297多態(tài)性在中國南方漢族人中與精神分裂癥無顯著性關聯(lián)。4個PCM1基因標簽SNP位點的等位基因頻率、基因型分布在病例組和正常對照組之間均無顯著性差異。PCM1基因可能不是中國南方漢族人精神分裂癥的易感基因。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.3
【圖文】：

ｒ邐Ｄ’逡逑圖３．１邋ＮＤＥＬｌ基因ＳＮＰｓ的連鎖不平衡分析示意圖（闡中未標注數(shù)字的方格代表相應兩個逡逑ＳＮＰ問Ｄ’或ｆ２為１）逡逑Ｆｉｇ．邋３．１邋ＳＮＰｓ邋ｌｉｎｋａｇｅ邋ｄｉｓｅｑｕｉｌ化ｒｉｕｍ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＮＤＥＬ１邋（化ｅ邋ｂｌａｎｋ邋ｓｑｕａｒｅ邋ｉｎ邋化ｅ邋ｆｉｇｕｒｅ逡逑ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋化ｅ邋ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ邋Ｄ邋＇ｏｒ邋Ｒ２邋ｉｓ邋ｅｑｕａｌ邋化邋１邋ｂｅｔｗｅｅ打邋ｔｈｅ邋ｔｗｏ邋ＳＮＰｓ）逡逑其余邋４邋個邋ＳＮＰ；邋ｒｓ８０６５８１２，邋ｒｓｌ３９１７６６，ｒｓ８０６４６５５，ｒｓ９３１６７２邋彼此問邋ｒ２均接近逡逑１，遠遠z┯冢埃常常崾菊獍幾觶櫻危兄始負跬耆�，发生重讬澳抠犉S約　ｅ義纖繡澹靛甯鰣澹櫻危繡邐叔澹摹�，ＯX迨導煎澹常澹卞逅盡＃潁螅福埃叮擔福保�，}螅歟常梗保罰叮叮潁螅福埃叮矗肚�，辶x希潁螅梗常保叮罰駁齲錘觶櫻危泄鉤梢桓齙ケ緞涂椋攏歟錚悖耄歟饕桑茫牽茫煤停裕茫裕粵礁齙ケ跺義閑凸鉤傘６哉飭礁齙ケ緞徒脅±哉輾治觶準靶員鴟植愕牟±哉輾治觶徨義瞎褪駒謐莧巳杭澳行�，女袆蛩群中，两庚_ケ緞停茫牽茫煤停裕茫裕雜刖穹至閻㈠義暇尷災喙匭�。结果见表３．邋ＹEｅ義

本文編號：2773299