發(fā)布時(shí)間：2020-07-21 12:52

【摘要】：DNA甲基化,作為表觀遺傳學(xué)的一個(gè)重要分支,可以通過調(diào)控記憶相關(guān)基因的狀態(tài)而參與到記憶的形成與鞏固過程中。DNA甲基化的調(diào)節(jié)主要受三種甲基轉(zhuǎn)移酶的催化。DNMT3a和DNMT3b為從頭甲基轉(zhuǎn)移酶,負(fù)責(zé)建立新的甲基化標(biāo)識(shí);DNMT1屬于維持甲基轉(zhuǎn)移酶,負(fù)責(zé)識(shí)別已有的甲基化標(biāo)識(shí)而維持甲修飾。三者的相互協(xié)調(diào)作用,使得甲基化在細(xì)胞分裂中可以保持延續(xù)性和穩(wěn)定性。目前多數(shù)的研究主要集中于dnmt3a和dnmt1上,對(duì)于dnmt3b的生物機(jī)制探討較少。因此我們針對(duì)dnmt3b在學(xué)習(xí)記憶方面的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)研究。我們通過基因芯片技術(shù),在dnmt3b基因敲除小鼠海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)了異常上調(diào)的st6gal2(β-Galactosideα2,6-Sialyltransferase 2)。st6gal2編碼的β-半乳糖α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶2(ST6Gal2))屬于唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族一員,主要分布于成年腦區(qū)(前額葉皮質(zhì)和海馬)并表達(dá)于組織特異時(shí)期(胚胎期)。研究發(fā)現(xiàn)st6gal2在小鼠胚胎發(fā)育期的表達(dá)是較為豐富的,而成年后則減少至較低水平。ST6Gal2將來自CMP-Sia中的唾液酸以α2,6-糖苷鍵的方式轉(zhuǎn)移到糖蛋白或者糖脂末端,通過唾液酸的負(fù)極性及親水性等特征參與到眾多生物學(xué)過程中,如細(xì)胞遷移,細(xì)胞粘附,細(xì)胞新陳代謝等。已有報(bào)道稱,唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族中相關(guān)成員對(duì)大腦神經(jīng)元的糖蛋白和糖脂的酸化修飾,對(duì)突觸可塑性起著重要的調(diào)節(jié)作用。但目前關(guān)于st6gal2的研究主要集中在腫瘤和癌癥方面,如甲狀腺癌,乳腺癌等,而在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能并沒有詳盡的報(bào)道。因此本次研究,我們旨在揭示st6gal2在小鼠學(xué)習(xí)記憶中的作用及機(jī)制。我們前期結(jié)果表示dnmt3b敲除小鼠會(huì)出現(xiàn)海馬依賴性位置識(shí)別記憶障礙,并伴有st6gal2表達(dá)顯著上調(diào)。因此我們推測(cè)可能是由于dnmt3b的敲除直接或間接引起的st6gal2的改變,進(jìn)而影響了小鼠神經(jīng)元信息的傳遞并產(chǎn)生記憶障礙。為了闡述這一機(jī)制,我們采用Cre-Loxp系統(tǒng)建立αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)條件性敲除小鼠模型,通過Real-time qPCR,Western blot實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證st6gal2的表達(dá)率;通過全基因組甲基化測(cè)序(Whole Genome Bisulfite Sequenceing,WGBS)分析相關(guān)基因的甲基化變化;通過記錄小鼠海馬區(qū)興奮性神經(jīng)元的突觸后電流和電位考察海馬突觸傳遞和可塑性的變化;采用小鼠海馬腦區(qū)注射ST6Gal2抗體和AAV-st6gal2-shRNA兩種手段糾正st6gal2表達(dá)上調(diào)后,觀察是否可以改善基因敲除小鼠海馬突觸功能的異常以及識(shí)別記憶的障礙�，F(xiàn)主要研究結(jié)果如下:1.Real-time qPCR和Western blot結(jié)果顯示αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠海馬區(qū)st6gal2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P0.0001);2.αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠海馬區(qū)st6gal2表達(dá)上調(diào)伴隨著ncam、st8sia2的顯著下調(diào)(P0.05),但st8sia 4的表達(dá)無改變(P0.05);3.αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠海馬區(qū)st6gal1、st8sia2、st8sia4、ncam基因3’UTR區(qū)以及ncam的CDS區(qū)的甲基化的改變影響了相關(guān)基因或功能蛋白的表達(dá);4.海馬SC-CA1(Schaffer Collateral-Cornu Ammonis 1)突觸通路成對(duì)脈沖反應(yīng)比值(PPR,Paired-Pulse Ratio)顯示兩組小鼠突觸前膜遞質(zhì)釋放效率無明顯差異(P0.05);5.αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠早期LTP(E-LTP)(P0.01)和晚期LTP(L-LTP)都存在異常;6.糾正st6gal2基因的表達(dá)上調(diào)可以改善αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)的LTP異常(P0.05);7.海馬CA1區(qū)微量注射ST6Gal2抗體(P0.05)和AAV-st6gal2-shRNA病毒(P0.01)可以改善αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠的物體位置識(shí)別記憶障礙;綜上所述,我們可以得出結(jié)論,選擇性在海馬興奮性神經(jīng)元內(nèi)敲除dnmt3b基因會(huì)引起st6gal1、st8sia2、st8sia4、ncam甲基化水平的變化而導(dǎo)致其m RNA的表達(dá)下調(diào),進(jìn)而觸發(fā)了st6gal2表達(dá)的代償性升高;并進(jìn)一步通過影響海馬神經(jīng)環(huán)路的突觸可塑性而干擾了海馬依賴的識(shí)別記憶過程,最終導(dǎo)致了αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠出現(xiàn)物體位置識(shí)別記憶障礙。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R749.1
【圖文】：

提示dnmt3b基因的敲除可能會(huì)引起DNMT3a和DNMT1 蛋白發(fā)生代償性改變。3. WGBS 結(jié)果顯示：st6gal1、st8sia2、st8sia4、ncam 甲基化水平降低差異甲基化區(qū)域 DMR 需滿足三個(gè)條件：1）有差異的 C 堿基占總 C 堿基的比例大于 50%；2）DMR 長(zhǎng)度大于 50bp；3）DMR 區(qū)域內(nèi)最少含 5 個(gè)堿基。我們將基因區(qū)間劃分為 up2K，5-UTR，CDS，intron，3-UTR，down2K，當(dāng)鑒定的 DMR 與任意區(qū)間有關(guān)聯(lián)交集達(dá) 50%以上，則定義為 DMR 關(guān)聯(lián)基因。在我們的 WGBS 報(bào)告中顯示，在 αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/flox小鼠中，st6gal1、st8sia2、st8sia4、ncam 均為DMR 關(guān)聯(lián)基因。在 CHH 區(qū)，st6gal1、st8sia2、st8sia4 甲基化水平分別降低 19.8%，25.7%，20.3%，主要發(fā)生在 3’UTR（19.8%，25.7%，20.3%）；而 ncam 下降 33.0%，在 3’UTR（34.4%）和 CDS（44.8%）區(qū)均有差異。CHG 區(qū)的 st8sia2 和 ncam 甲基化水平分別下降 25.4%、38.7%，主要在 3’UTR（25.4%，38.4%）區(qū)。而在 CG 區(qū)僅有 ncam 在 introns 區(qū)下降 14.0%。而 st6gal1 在內(nèi)含子區(qū)也存在差異甲基化（資料未顯示）。ab

4.1.1 Real-time qPCR 結(jié)果顯示，αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/flox小鼠 st6gal2 基因表達(dá)顯著上調(diào)我們的前期研究通過運(yùn)用基因芯片技術(shù)對(duì) dnmt3b 敲除小鼠海馬區(qū)差異表達(dá)的基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn) st6gal2 基因的變化最為顯著。我們用 Real-time qPCR 技術(shù)對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示，條件敲除性小鼠的 st6gal2 基因的變化同前期結(jié)果一致，均表現(xiàn)為顯著上調(diào)，可達(dá) 2.5 倍以上（unpaired t-test，t=5.035，P<0.0001， dnmt3bflox/floxn=15，αCaMKII-Cre; dnmt3bflox/floxn=13，圖 3a）。提示 st6gal2 基因的上調(diào)可能與dnmt3b 基因的敲除相關(guān)。4.1.2 Western blot 結(jié)果顯示，αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/flox小鼠 ST6Gal2 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)為了進(jìn)一步驗(yàn)證，st6gal2 基因的改變是否會(huì)引起功能性的蛋白的變化，我們采用了 Western blot 的方法對(duì) ST6Gal2 蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基本與 Real-timeqPCR 的結(jié)果一致。（unpaired t-test，t=4.005， P<0.01， dnmt3bflox/floxn=7， αCaMKII-Cre; dnmt3bflox/floxn=7，圖 3b）。

結(jié)果 of αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/floxmice increased significantly. unpaired3bflox/floxn=15, αCaMKII-Cre; dnmt3bflox/floxn=13. b: ST6Gal2 protein paired t-test, t=4.005, P<0.01, dnmt3bflox/floxn=7, αCaMKII-Cre; dnmqPCR 結(jié)果顯示, αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/flox小鼠 n著下調(diào)，而 st8sia4 表達(dá)未受影響們的猜想，是否 st6gal2 異常增高伴隨著 st8sia 家族成員Real-time PCR 檢測(cè)了海馬區(qū) DMR 關(guān)聯(lián)基因的 mRNA 表sia2 表達(dá)顯著下調(diào)，而 st8sia4 表達(dá)未發(fā)生變化（ncam，un5。st8sia2，unpaired t-test，t=2.552，P<0.05。st8sia4，un.05，圖 4）。

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5 王

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