【摘要】：DNA甲基化,作為表觀遺傳學的一個重要分支,可以通過調控記憶相關基因的狀態(tài)而參與到記憶的形成與鞏固過程中。DNA甲基化的調節(jié)主要受三種甲基轉移酶的催化。DNMT3a和DNMT3b為從頭甲基轉移酶,負責建立新的甲基化標識;DNMT1屬于維持甲基轉移酶,負責識別已有的甲基化標識而維持甲修飾。三者的相互協(xié)調作用,使得甲基化在細胞分裂中可以保持延續(xù)性和穩(wěn)定性。目前多數(shù)的研究主要集中于dnmt3a和dnmt1上,對于dnmt3b的生物機制探討較少。因此我們針對dnmt3b在學習記憶方面的調節(jié)作用和機制進行了相關研究。我們通過基因芯片技術,在dnmt3b基因敲除小鼠海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)了異常上調的st6gal2(β-Galactosideα2,6-Sialyltransferase 2)。st6gal2編碼的β-半乳糖α2,6-唾液酸轉移酶2(ST6Gal2))屬于唾液酸轉移酶家族一員,主要分布于成年腦區(qū)(前額葉皮質和海馬)并表達于組織特異時期(胚胎期)。研究發(fā)現(xiàn)st6gal2在小鼠胚胎發(fā)育期的表達是較為豐富的,而成年后則減少至較低水平。ST6Gal2將來自CMP-Sia中的唾液酸以α2,6-糖苷鍵的方式轉移到糖蛋白或者糖脂末端,通過唾液酸的負極性及親水性等特征參與到眾多生物學過程中,如細胞遷移,細胞粘附,細胞新陳代謝等。已有報道稱,唾液酸轉移酶家族中相關成員對大腦神經元的糖蛋白和糖脂的酸化修飾,對突觸可塑性起著重要的調節(jié)作用。但目前關于st6gal2的研究主要集中在腫瘤和癌癥方面,如甲狀腺癌,乳腺癌等,而在神經系統(tǒng)中的功能并沒有詳盡的報道。因此本次研究,我們旨在揭示st6gal2在小鼠學習記憶中的作用及機制。我們前期結果表示dnmt3b敲除小鼠會出現(xiàn)海馬依賴性位置識別記憶障礙,并伴有st6gal2表達顯著上調。因此我們推測可能是由于dnmt3b的敲除直接或間接引起的st6gal2的改變,進而影響了小鼠神經元信息的傳遞并產生記憶障礙。為了闡述這一機制,我們采用Cre-Loxp系統(tǒng)建立αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)條件性敲除小鼠模型,通過Real-time qPCR,Western blot實驗方法驗證st6gal2的表達率;通過全基因組甲基化測序(Whole Genome Bisulfite Sequenceing,WGBS)分析相關基因的甲基化變化;通過記錄小鼠海馬區(qū)興奮性神經元的突觸后電流和電位考察海馬突觸傳遞和可塑性的變化;采用小鼠海馬腦區(qū)注射ST6Gal2抗體和AAV-st6gal2-shRNA兩種手段糾正st6gal2表達上調后,觀察是否可以改善基因敲除小鼠海馬突觸功能的異常以及識別記憶的障礙。現(xiàn)主要研究結果如下:1.Real-time qPCR和Western blot結果顯示αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠海馬區(qū)st6gal2 mRNA和蛋白表達均顯著上調(P0.0001);2.αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠海馬區(qū)st6gal2表達上調伴隨著ncam、st8sia2的顯著下調(P0.05),但st8sia 4的表達無改變(P0.05);3.αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠海馬區(qū)st6gal1、st8sia2、st8sia4、ncam基因3’UTR區(qū)以及ncam的CDS區(qū)的甲基化的改變影響了相關基因或功能蛋白的表達;4.海馬SC-CA1(Schaffer Collateral-Cornu Ammonis 1)突觸通路成對脈沖反應比值(PPR,Paired-Pulse Ratio)顯示兩組小鼠突觸前膜遞質釋放效率無明顯差異(P0.05);5.αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠早期LTP(E-LTP)(P0.01)和晚期LTP(L-LTP)都存在異常;6.糾正st6gal2基因的表達上調可以改善αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)的LTP異常(P0.05);7.海馬CA1區(qū)微量注射ST6Gal2抗體(P0.05)和AAV-st6gal2-shRNA病毒(P0.01)可以改善αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠的物體位置識別記憶障礙;綜上所述,我們可以得出結論,選擇性在海馬興奮性神經元內敲除dnmt3b基因會引起st6gal1、st8sia2、st8sia4、ncam甲基化水平的變化而導致其m RNA的表達下調,進而觸發(fā)了st6gal2表達的代償性升高;并進一步通過影響海馬神經環(huán)路的突觸可塑性而干擾了海馬依賴的識別記憶過程,最終導致了αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠出現(xiàn)物體位置識別記憶障礙。
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R749.1
【圖文】：

提示dnmt3b基因的敲除可能會引起DNMT3a和DNMT1 蛋白發(fā)生代償性改變。3. WGBS 結果顯示：st6gal1、st8sia2、st8sia4、ncam 甲基化水平降低差異甲基化區(qū)域 DMR 需滿足三個條件：1）有差異的 C 堿基占總 C 堿基的比例大于 50%；2）DMR 長度大于 50bp；3）DMR 區(qū)域內最少含 5 個堿基。我們將基因區(qū)間劃分為 up2K，5-UTR，CDS，intron，3-UTR，down2K，當鑒定的 DMR 與任意區(qū)間有關聯(lián)交集達 50%以上，則定義為 DMR 關聯(lián)基因。在我們的 WGBS 報告中顯示，在 αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/flox小鼠中，st6gal1、st8sia2、st8sia4、ncam 均為DMR 關聯(lián)基因。在 CHH 區(qū)，st6gal1、st8sia2、st8sia4 甲基化水平分別降低 19.8%，25.7%，20.3%，主要發(fā)生在 3’UTR（19.8%，25.7%，20.3%）；而 ncam 下降 33.0%，在 3’UTR（34.4%）和 CDS（44.8%）區(qū)均有差異。CHG 區(qū)的 st8sia2 和 ncam 甲基化水平分別下降 25.4%、38.7%，主要在 3’UTR（25.4%，38.4%）區(qū)。而在 CG 區(qū)僅有 ncam 在 introns 區(qū)下降 14.0%。而 st6gal1 在內含子區(qū)也存在差異甲基化（資料未顯示）。ab

4.1.1 Real-time qPCR 結果顯示，αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/flox小鼠 st6gal2 基因表達顯著上調我們的前期研究通過運用基因芯片技術對 dnmt3b 敲除小鼠海馬區(qū)差異表達的基因進行篩選，發(fā)現(xiàn) st6gal2 基因的變化最為顯著。我們用 Real-time qPCR 技術對此進行了驗證，結果顯示，條件敲除性小鼠的 st6gal2 基因的變化同前期結果一致，均表現(xiàn)為顯著上調，可達 2.5 倍以上（unpaired t-test，t=5.035，P<0.0001， dnmt3bflox/floxn=15，αCaMKII-Cre; dnmt3bflox/floxn=13，圖 3a）。提示 st6gal2 基因的上調可能與dnmt3b 基因的敲除相關。4.1.2 Western blot 結果顯示，αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/flox小鼠 ST6Gal2 蛋白表達顯著上調為了進一步驗證，st6gal2 基因的改變是否會引起功能性的蛋白的變化，我們采用了 Western blot 的方法對 ST6Gal2 蛋白進行了檢測。結果發(fā)現(xiàn)基本與 Real-timeqPCR 的結果一致。（unpaired t-test，t=4.005， P<0.01， dnmt3bflox/floxn=7， αCaMKII-Cre; dnmt3bflox/floxn=7，圖 3b）。

結果 of αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/floxmice increased significantly. unpaired3bflox/floxn=15, αCaMKII-Cre; dnmt3bflox/floxn=13. b: ST6Gal2 protein paired t-test, t=4.005, P<0.01, dnmt3bflox/floxn=7, αCaMKII-Cre; dnmqPCR 結果顯示, αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/flox小鼠 n著下調，而 st8sia4 表達未受影響們的猜想，是否 st6gal2 異常增高伴隨著 st8sia 家族成員Real-time PCR 檢測了海馬區(qū) DMR 關聯(lián)基因的 mRNA 表sia2 表達顯著下調，而 st8sia4 表達未發(fā)生變化（ncam，un5。st8sia2，unpaired t-test，t=2.552，P<0.05。st8sia4，un.05，圖 4）。

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本文編號：2764441