【摘要】：精神分裂癥(schizophrenia, SZ)是遺傳易感性、發(fā)育障礙和環(huán)境不利因素綜合作用的結(jié)果,它的確切病因還不能準(zhǔn)確地鑒定。近幾年來的研究表明,可能與早期發(fā)育過程中,多條信號(hào)通路的易感基因的累加效應(yīng)有關(guān)。其中,Wnt信號(hào)通路功能低下可導(dǎo)致SZ。Wnt信號(hào)通路與脊椎動(dòng)物胚胎期模式發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖有關(guān)。另外,Wnt信號(hào)通路在中腦形成和中腦多巴胺(Dopamine, DA)能神經(jīng)元的增殖和分化起到重要作用。 有研究表明,成年神經(jīng)發(fā)生和早期發(fā)育是相似的,也包括前體細(xì)胞的增殖、遷移、分化,最終形成與現(xiàn)存的神經(jīng)元無差別的神經(jīng)元。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)這一過程。這個(gè)過程受干擾,會(huì)出現(xiàn)腦神經(jīng)功能異常的病癥,如SZ。也有研究者發(fā)現(xiàn)SZ患者體內(nèi)Wnt通路的負(fù)性調(diào)節(jié)基因腺瘤性結(jié)腸息肉病基因(Adenomatous polyposis Coli, APC) mRNA的表達(dá)升高。 同時(shí),SZ患者表現(xiàn)為一定的神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào),例如谷氨酸功能低下,多巴胺能亢進(jìn)。但神經(jīng)遞質(zhì)失衡和Wnt信號(hào)低下在形成SZ過程中的關(guān)系仍未可知。我們推測(cè),Wnt信號(hào)通路的異常改變,導(dǎo)致beta-連環(huán)蛋白(β-catenin)介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄障礙,可能對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的平衡,甚至相關(guān)受體的分布產(chǎn)生影響,這可能是Wnt信號(hào)低下產(chǎn)生SZ的原因之一。 為了論證Wnt信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)平衡和受體分布有調(diào)節(jié)作用,以探討SZ的可能的分子發(fā)病機(jī)制,我們將研究分為三部分： (1)SZ小鼠模型的建立。我們預(yù)設(shè)了一種神經(jīng)遞質(zhì)的失衡狀態(tài),即谷氨酸功能低下的狀態(tài)。通過用0.6mg/kg腹腔注射地卓西平(MK-801)處理小鼠造成谷氨酸功能低下而誘導(dǎo)出類似SZ的動(dòng)物模型。用藥一次制作急性模型。用藥7d,每天一次,制作亞慢性模型。檢驗(yàn)小鼠模型的典型的行為學(xué)表現(xiàn)：高運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、刻板性動(dòng)作以明確小鼠模型的有效性。用0.9mg/kg抗精神病藥物利培酮急性和亞慢性腹腔注射處理小鼠模型和正常小鼠作為對(duì)照研究。 (2)小鼠模型腦內(nèi)Wnt信號(hào)通路活性和DA能神經(jīng)元活性的檢測(cè)①通過Western Blotting (WB)和免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry, IFC)的方法檢測(cè)該動(dòng)物模型前額葉皮質(zhì)(prefrontal cortex, PFC)和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area, VTA)腦區(qū)內(nèi)Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子APC,糖原合成酶激酶-3beta (GSK-3p)和磷酸化的GSK-3p, p-catenin及磷酸化的β-catenin的含量和分布是否改變；②檢測(cè)PFC和VTA腦區(qū)的另一種神經(jīng)遞質(zhì)是否發(fā)生改變。考慮到DA與SZ的癥狀密切有關(guān),故本研究通過WB和IFC的方法檢測(cè)DA的合成限速酶酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)以判斷DA能神經(jīng)元的興奮性；③通過RT-PCR, Real Time PCR的方法,在RNA水平檢測(cè)Wnt信號(hào)通路分子的表達(dá)�？紤]到Wnt信號(hào)通路可能存在與其他信號(hào)通路的交叉對(duì)話(crosstalk),故檢測(cè)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/GSK-3 (PI3K/Akt/GSK-3)通路的關(guān)鍵分子Akt的mRNA水平；④檢測(cè)PFC和VTA腦區(qū)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元經(jīng)MK-801和利培酮處理后,Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)改變；⑤選擇利培酮0.9mg/kg亞慢性腹腔注射處理的正常小鼠作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn),以p0.01作為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。 (3)亞慢性小鼠模型受體重塑檢測(cè)和APC蛋白促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)檢測(cè)①通過RT-PCR、Real Time PCR的方法檢測(cè)N-甲基-D-天(門)冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMD A)受體2B亞單位(N-methyl-D-aspartate receptor 2B subtype, NR2B)在PFC和VTA腦區(qū)的表達(dá)是否出現(xiàn)改變；②通過IFC觀測(cè)正常生長(zhǎng)的SK-N-SH細(xì)胞和經(jīng)過神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)刺激分化的PC12細(xì)胞中,APC蛋白的定位和分布；③檢測(cè)APC蛋白在促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)過程中所起的作用。構(gòu)建APC siRNA表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染SK-N-SH和PC12細(xì)胞,觀察APC蛋白含量變化及對(duì)細(xì)胞突起生長(zhǎng)的影響。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論如下： (1)MK-801誘導(dǎo)的SZ小鼠的行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果。以0.6mg/kg腹腔注射MK-801后,約15分鐘后小鼠出現(xiàn)高運(yùn)動(dòng)狀態(tài),曠場(chǎng)跑動(dòng)加快,伴有明顯的刻板性動(dòng)作,如10～20次/min的轉(zhuǎn)圈,100～150次/min的不自主擺頭,對(duì)環(huán)境的探究、警覺意識(shí)喪失。群體性活動(dòng)喪失。用藥后30min最明顯,持續(xù)約90min。行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明：MK-801SZ小鼠模型具備SZ的陽性癥狀、陰性癥狀和認(rèn)知缺陷的大部分。模型的穩(wěn)定性和重復(fù)性好。 (2)SZ小鼠模型PFC和VTA腦區(qū)內(nèi)Wnt通路關(guān)鍵分子表達(dá)的變化①WB結(jié)果顯示：急性小鼠模型未見APC和其他Wnt通路組件的明顯改變。在亞慢性小鼠模型腦的PFC和VTA腦區(qū)出現(xiàn)APC蛋白、磷酸化β-catenin蛋白和磷酸化GSK-3β的表達(dá)明顯上調(diào)。IHC結(jié)果顯示：亞慢性小鼠模型的PFC和VTA腦區(qū)APC蛋白免疫陽性增加；②WB方法顯示：亞慢性小鼠模型PFC腦區(qū)TH蛋白的表達(dá)明顯上升,VTA腦區(qū)的TH未見明顯改變；③RT-PCR和Real TimePCR的檢測(cè)表明：亞慢性小鼠模型PFC和VTA腦區(qū)APC、β-catenin和GSK-3p mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào),PFC區(qū)Akt mRNA表達(dá)上調(diào)；④RT-PCR的方法檢測(cè)到：在PFC和VTA腦區(qū)培養(yǎng)的原代神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)0.6g/ml MK-801處理后,β-catenin mRNA表達(dá)均上調(diào)；⑤WB的方法檢測(cè)到：用利培酮亞慢性處理正常小鼠,引起PFC區(qū)和VTA區(qū)磷酸化β-catenin的表達(dá)上調(diào),同時(shí)引起VTA腦區(qū)APC蛋白的下調(diào)表達(dá)。但對(duì)PFC區(qū)APC蛋白的表達(dá)無明顯影響,對(duì)PFC和VTA區(qū)TH蛋白的表達(dá)無明顯影響。另外,RT-PCR結(jié)果表明利培酮亞慢性處理引起小鼠PFC區(qū)Akt mRNA的表達(dá)下降。以上結(jié)果提示：Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子活性改變與SZ的發(fā)作有關(guān)。PFC腦區(qū)DA能活性增強(qiáng)可能是發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。利培酮的抗精神病作用可能與Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子活性調(diào)節(jié)有關(guān)。Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子APC和P-catenin活性改變與Akt/GSK通路有關(guān)。 (3)亞慢性模型小鼠NMDA受體重塑檢測(cè)和APC蛋白促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果。①RT-PCR和Real Time PCR方法顯示：亞慢性模型小鼠的PFC的組織NR2B的mRNA表達(dá)水平明顯升高；②IFC方法顯示：APC蛋白大量表達(dá)于SK-N-SH細(xì)胞胞體和類神經(jīng)突起結(jié)構(gòu)的頂端,而在類神經(jīng)突起的干部(shaft segments)較少存在；③APC siRNA轉(zhuǎn)染SK-N-SH和PC12細(xì)胞后,明顯抑制細(xì)胞突起的延伸。本部分結(jié)果提示：NMDA受體重塑在亞慢性小鼠模型中是存在的。APC蛋白對(duì)于神經(jīng)突起的延伸和重塑起到重要作用。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R749.3
【圖文】：

受體結(jié)合后，激活Dishevelled(Dsh)蛋白質(zhì)復(fù)合體，使GSK一3被磷酸化而失去活性。胞漿內(nèi)的p一catenin含量上升，部分p一catenin進(jìn)入細(xì)胞核與TcF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并啟動(dòng)下游特定基因，如c一myc的表達(dá)[42， 43](圖1)。APC蛋白是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子。抑制p一catenin在核內(nèi)聚集，防止細(xì)胞過度增生。APC蛋白還是一種多功能的細(xì)胞骨架蛋白。首先，通過它的梭基端，APC蛋白可結(jié)合到包含有PDz的蛋白分子上，如PsD一95、hDlg等【44]。這種復(fù)合分子可能在上皮發(fā)生、腦發(fā)育、神經(jīng)功能維持等方面起到重要作用。第二，APC通過它的Armadillo重復(fù)結(jié)構(gòu)域與Asef連結(jié)，組成蛋白復(fù)合物，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移和神經(jīng)功能I45]。己有臨床資料表明，APC基因突變與精神性疾病的發(fā)生有一定的關(guān)系。在一例Gardner綜合征伴有重度精神發(fā)育遲

急性和亞慢性模型鼠的刻板性動(dòng)作(轉(zhuǎn)圈)曲線圖

020406080100120140160180時(shí)間(分鐘)圖1一1急性和亞慢性模型鼠的刻板性動(dòng)作(轉(zhuǎn)圈)曲線圖Q自八日00八 4b0山門曰.上J.土燕影側(cè)側(cè)示求嗽舊 020406080100120140160180時(shí)間(分鐘)圖1一2急性和亞慢性模型鼠的直立動(dòng)作曲線圖

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 崔東紅,姚華,王新源,朱濱,江開達(dá);精神分裂癥患者外周血白細(xì)胞基因差異表達(dá)的基因芯片研究[J];中華精神科雜志;2004年01期

本文編號(hào)：2756843