【摘要】：阿爾茲海默病(alzheimer’s disease,AD),又稱為老年癡呆癥。AD是致死性神經(jīng)退行性疾病,主要表現(xiàn)為認(rèn)知障礙和記憶能力下降。隨著人類老齡化的不斷發(fā)展,AD的發(fā)病率也逐年升高。AD的病因較為復(fù)雜,且AD的發(fā)病機(jī)理目前還尚不明確,因此迄今為止還沒有確切的治療方法。在最近幾年的研究中,有利用神經(jīng)干細(xì)胞移植來改善AD病鼠的記憶能力。但神經(jīng)干細(xì)胞來源有限,大多來自胚胎組織,而且還有社會倫理之爭。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells,hAM-MSCs),是從新生兒的胎盤上分離培養(yǎng)的干細(xì)胞,作為醫(yī)療廢棄物,其來源廣泛、免疫原性低、安全可靠,且無醫(yī)學(xué)倫理之爭。有研究將其用于治療創(chuàng)傷性腦損傷,發(fā)現(xiàn)hAM-MSCs能夠促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。有研究將hAM-MSCs移植至阿爾茲海默病鼠中,發(fā)現(xiàn)小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力有增強(qiáng)的趨勢,可見其有緩解AD病患者癥狀的潛能。研究發(fā)現(xiàn),人間充質(zhì)干細(xì)胞具有調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的功能,例如:T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等,進(jìn)而可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。據(jù)研究,人間充質(zhì)干細(xì)胞在造血干細(xì)胞移植導(dǎo)致的移植物抗宿主病以及自身免疫系統(tǒng)疾病方面具有良好的治療效果。小分子核糖核酸(miRNA)是一類小的非編碼RNA,可以通過結(jié)合靶基因的3'UTR特定位點控制基因表達(dá),導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制或退化。miRNA在細(xì)胞分化、增殖和凋亡等過程中具有重要的調(diào)節(jié)功能。有研究發(fā)現(xiàn)miR-21可以靶向抑制TGFBR2的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)TGF信號在人脂肪組織提取干細(xì)胞(human Adiposederived Stem Cells,hASCs)細(xì)胞分化中的作用。最近,miRNA被報道為神經(jīng)退行性疾病和影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生物標(biāo)記物,且發(fā)現(xiàn)血清miRNA有作為AD的診斷生物標(biāo)志物的潛在作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-21是一種重要的神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子,其高表達(dá)有助于神經(jīng)功能障礙恢復(fù)。但miR-21在阿爾茲海默病的作用和機(jī)制還未知曉。本課題主要目的是研究miR-21介導(dǎo)的hAM-MSCs對阿爾茲海默病的影響和可能的機(jī)制,首先以新生兒胎盤分離培養(yǎng)的hAM-MSCs作為研究材料,分析了miR-21在hAM-MSCs以及AD病鼠中的表達(dá)及意義,然后,構(gòu)建miR-21過表達(dá)和干擾慢病毒載體及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的hAM-MSCs細(xì)胞,并探究了miR-21過表達(dá)和干擾對hAM-MSCs細(xì)胞增殖、凋亡、周期以及miR-21介導(dǎo)的hAM-MSCs對人外周血單個核細(xì)胞中TNF-α、MCP-1和IL-10表達(dá)的影響,最后,進(jìn)一步利用APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型,體內(nèi)研究了miR-21對hAM-MSCs在AD病鼠腦內(nèi)歸巢和存活的影響,利用水迷宮實驗對miR-21對hAM-MSCs移植后AD病鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力進(jìn)行了檢測,同時,檢測了miR-21對hAM-MSCs移植AD病鼠海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志抗原和炎癥因子的表達(dá)情況。本研究主要分為三部分進(jìn)行:第一部分:miR-21在人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞以及AD病鼠中的表達(dá)及意義研究;第二部分:miR-21對hAM-MSCs生物學(xué)特性以及免疫調(diào)節(jié)作用的影響研究;第三部分:miR-21對hAM-MSCs在AD病鼠腦內(nèi)遷移以及炎癥因子表達(dá)的影響研究。主要內(nèi)容:第一部分miR-21在人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞以及AD病鼠中的表達(dá)及意義研究方法1.從新生兒胎盤羊膜中分離培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞hAM-MSCs。2.用流式細(xì)胞儀分析hAM-MSCs細(xì)胞表面標(biāo)記,用免疫熒光檢測表面抗原Vimentin和SSEA-4,以鑒定hAM-MSCs細(xì)胞。3.qRT-PCR檢測miR-21在人羊膜上皮細(xì)胞與hAM-MSCs中的表達(dá)情況。4.qRT-PCR檢測miR-21在正常小鼠與AD病鼠海馬組織中的表達(dá)。結(jié)果1.對第3代hAM-MSCs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測分析,發(fā)現(xiàn)hAM-MSCs中CD29、CD44、CD73、CD90陽性表達(dá)率分別為97.3%、96.3%、97.8%、98.2%,而CD34、CD45表達(dá)僅0.6%、0.84%。對hAM-MSCs細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)Vimentin和SSEA-4兩種細(xì)胞表面抗原均在hAM-MSCs細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá)。結(jié)果表明,成功分離到純度較高的具有間充質(zhì)干細(xì)胞特點的hAM-MSCs。2.qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-21在hAM-MSCs中的表達(dá)量明顯高于羊膜上皮細(xì)胞,且miR-21在AD病鼠海馬組織中的表達(dá)量明顯低于正常鼠。第二部分miR-21對hAM-MSCs生物學(xué)特性以及免疫調(diào)節(jié)作用的影響研究方法1.構(gòu)建miR-21過表達(dá)慢病毒載體:將miR-21和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro連接,構(gòu)建miR-21過表達(dá)慢病毒載體pLent-miR-21,菌落PCR鑒定,并送公司測序。2.miR-21干擾慢病毒載體:將anti-miR-21和pLent-hU6-GFP-Puro連接,構(gòu)建miR-21干擾慢病毒載體pLent-anti-miR-21,菌落PCR鑒定,并送公司測序。3.對重組慢病毒載體進(jìn)行病毒包裝,滴度測定重組慢病毒的滴度值。4.LV-miR-21和LV-anti-miR-21分別感染hAM-MSCs,得到穩(wěn)定細(xì)胞系hAM-MSCs-miR-21和hAM-MSCs-anti-miR-21。5.qRT-PCR檢測hAM-MSCs、hAM-MSCs-miR-21和hAM-MSCs-anti-miR-21細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平。6.CCK-8實驗檢測miR-21對hAM-MSCs細(xì)胞增殖的影響。7.流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-21對hAM-MSCs細(xì)胞周期的影響。8.流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-21對hAM-MSCs細(xì)胞凋亡的影響。9.ELISA檢測hAM-MSCs與人外周血單個核細(xì)胞共培養(yǎng)上清中TNF-α、MCP-1和IL-10的含量。結(jié)果1.pLent-miR-21和pLent-anti-miR-21慢病毒載體菌落PCR和測序結(jié)果顯示,其分子大小及序列與NCBI中的參考序列一致。表明pLent-miR-21和pLent-anti-miR-21慢病毒載體構(gòu)建成功。2.經(jīng)測定LV-miR-21、LV-anti-miR-21病毒滴定值為2×10~8 TU/mL。用LV-miR-21,LV-anti-miR-21感染hAM-MSCs,觀察熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),大部分細(xì)胞有綠色熒光表現(xiàn),說明病毒感染效率較高。3.與hAM-MSCs組相比,hAM-MSCs-miR-21組miR-21表達(dá)量明顯升高,而hAM-MSCs-anti-miR-21組miR-21明顯降低,說明我們成功構(gòu)建了miR-21過表達(dá)和干擾細(xì)胞系。4.CCK-8實驗檢測發(fā)現(xiàn)miR-21過表達(dá)顯著促進(jìn)hAM-MSCs細(xì)胞的增殖,而miR-21干擾則抑制hAM-MSCs細(xì)胞的增殖。5.流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)與hAM-MSCs對照組相比,miR-21過表達(dá)后S期細(xì)胞比例明顯增多,miR-21表達(dá)受干擾后S期細(xì)胞比例明顯減少。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)miR-21過表達(dá)明顯抑制hAM-MSCs的凋亡,而miR-21干擾明顯促進(jìn)hAM-MSCs的凋亡。7.ELISA檢測發(fā)現(xiàn),與人外周血單個核細(xì)胞相比,hAM-MSCs與人外周血單個核細(xì)胞共培養(yǎng)后,hAM-MSCs明顯抑制人外周血單個核細(xì)胞對TNF-α、MCP-1的分泌,促進(jìn)對IL-10的分泌;與hAM-MSCs與人外周血單個核細(xì)胞共培養(yǎng)組相比,miR-21過表達(dá)后明顯增強(qiáng)hAM-MSCs對人外周血單個核細(xì)胞分泌TNF-α、MCP-1的抑制作用,及人外周血單個核細(xì)胞分泌IL-10的促進(jìn)作用,而miR-21表達(dá)受干擾后明顯抑制hAM-MSCs對人外周血單個核細(xì)胞分泌TNF-α、MCP-1的抑制作用,及人外周血單個核細(xì)胞分泌IL-10的促進(jìn)作用。第三部分miR-21對hAM-MSCs在AD病鼠腦內(nèi)遷移以及炎癥因子表達(dá)的影響研究方法1.對實驗所用的APP轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行PCR鑒定。2.對AD病鼠進(jìn)行hAM-MSCs尾靜脈移植,并用熒光檢測靜脈移植后hAM-MSCs在小鼠腦部的歸巢和存活情況。3.Morris水迷宮:定位航行實驗及空間探索實驗檢測各組AD病鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。4.免疫組化、qRT-PCR和Western blot檢測AD病鼠海馬組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志抗原GFAP、Nestin和NSE的表達(dá)情況。5.Western blot檢測AD病鼠海馬組織中增殖(Ki67)及凋亡相關(guān)蛋白(Caspase-3、Bax、Bcl-2)的表達(dá);并檢測AD病鼠海馬組中內(nèi)TNF-α、MCP-1和IL-10的表達(dá)。結(jié)果1.通過尾靜脈hAM-MSCs細(xì)胞移植后,與hAM-MSCs組相比,在AD病鼠腦部,hAM-MSCs中miR-21過表達(dá)后存活的熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量明顯增多,且熒光標(biāo)記細(xì)胞隨著時間延長先增加后減少,而干擾miR-21表達(dá)后熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目明顯減少,且存活時間較短�？梢妋iR-21過表達(dá)可促進(jìn)hAM-MSCs在AD病鼠腦內(nèi)的歸巢和存活。2.與生理鹽水組相比,hAM-MSCs尾靜脈移植的AD病鼠穿越平臺次數(shù)明顯增加,平臺象限停留時間百分比明顯升高,逃避潛伏期時間明顯縮短。另外,與hAM-MSCs組相比,miR-21過表達(dá)后經(jīng)hAM-MSCs尾靜脈移植的AD病鼠穿越平臺次數(shù)明顯增加,平臺象限停留時間百分比明顯升高,逃避潛伏期時間明顯縮短;miR-21表達(dá)受干擾后小鼠穿越平臺次數(shù)明顯減少,平臺象限停留時間百分比明顯降低,逃避潛伏期明顯增長。說明miR-21過表達(dá)能夠促進(jìn)hAM-MSCs尾靜脈移植有效改善AD病鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力,對具有AD癥狀的小鼠有治療作用。3.與生理鹽水組相比,hAM-MSCs尾靜脈移植的AD病鼠海馬組織中,Ki67和Bcl-2的表達(dá)量明顯升高,而Caspase-3和Bax的表達(dá)量明顯降低。另外,經(jīng)hAM-MSCs尾靜脈移植的AD病鼠海馬組織中,miR-21過表達(dá)后Ki67和Bcl-2的表達(dá)量明顯升高,而Caspase-3和Bax的表達(dá)量明顯降低;miR-21表達(dá)受干擾后Ki67和Bcl-2的表達(dá)量明顯降低,而Caspase-3和Bax的表達(dá)量明顯升高。4.免疫組化、qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與生理鹽水組相比,hAM-MSCs尾靜脈移植的AD病鼠海馬組織中,神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志抗原GFAP、Nestin和NSE的表達(dá)明顯增加。另外,經(jīng)hAM-MSCs尾靜脈移植的AD病鼠海馬組織中,miR-21過表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志抗原GFAP、Nestin和NSE的表達(dá);而miR-21表達(dá)受干擾后,小鼠海馬組織內(nèi)GFAP、Nestin和NSE的表達(dá)量明顯降低。5.與生理鹽水組相比,hAM-MSCs尾靜脈移植的AD病鼠海馬組織中,促炎因子TNF-α、MCP-1的表達(dá)顯著減少,而抑炎因子IL-10的表達(dá)顯著增加。另外,經(jīng)hAM-MSCs尾靜脈移植的AD病鼠海馬組織中,miR-21過表達(dá)顯著抑制TNF-α、MCP-1的表達(dá),促進(jìn)IL-10的表達(dá)量。而miR-21表達(dá)受干擾后,小鼠海馬組織內(nèi)TNF-α和MCP-1的表達(dá)量明顯升高,而IL-10的表達(dá)量明顯降低。全文結(jié)論1.本研究分離獲得了純度較高的hAM-MSCs,miR-21在hAM-MSCs中的表達(dá)量明顯高于人羊膜上皮細(xì)胞,而miR-21在AD病鼠海馬組織中的表達(dá)量明顯低于正常鼠。2.miR-21過表達(dá)顯著促進(jìn)hAM-MSCs細(xì)胞的增殖,抑制其凋亡,提高S期細(xì)胞比例,并增強(qiáng)hAM-MSCs對人外周血單個核細(xì)胞分泌TNF-α、MCP-1的抑制作用,及人外周血單個核細(xì)胞分泌IL-10的促進(jìn)作用;而miR-21干擾則抑制hAM-MSCs細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,降低S期細(xì)胞比例,并抑制hAM-MSCs對人外周血單個核細(xì)胞分泌TNF-α、MCP-1的抑制作用,及人外周血單個核細(xì)胞分泌IL-10的促進(jìn)作用。3.動物體內(nèi)研究結(jié)果表明,miR-21過表達(dá)增強(qiáng)hAM-MSCs尾靜脈移植對AD病鼠海馬組織中Ki67和Bcl-2表達(dá)的促進(jìn)作用,及Caspase-3和Bax表達(dá)的抑制作用。miR-21過表達(dá)增強(qiáng)hAM-MSCs尾靜脈移植對AD病鼠海馬組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志抗原GFAP、Nestin和NSE表達(dá)的促進(jìn)作用,促進(jìn)腦組織中神經(jīng)損傷的修復(fù)和再生。另外,miR-21過表達(dá)能夠增強(qiáng)hAM-MSCs尾靜脈移植對AD病鼠海馬組織內(nèi)TNF-α和MCP-1表達(dá)的抑制作用,IL-10表達(dá)的促進(jìn)作用,減輕局部炎癥反應(yīng),減少神經(jīng)元的損傷。miR-21干擾則有效抑制該效應(yīng)。表明miR-21過表達(dá)的hAM-MSCs尾靜脈移植能夠有效改善AD病鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力,對具有AD癥狀的小鼠有治療作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R749.16
【圖文】：

上下混勻，放置 10 min，12000 rpm 離心 10 min。4）棄上清液，加入 1 mL 的 75%乙醇，混勻，4℃下 12000 rpm 離心 5 5）棄上清液，干燥 10 min。用 30 mL DEPC 水將 RNA 溶解，保存于-8然后將提取的 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，進(jìn)行 qRT-PCR。具體方法步驟同 數(shù)據(jù)分析用 SPSS13.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x s）表示，進(jìn)行方差分析和 t 檢驗。以 P < 0.05 為差異有顯著性。結(jié)果 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞 hAM-MSCs 的分離和培養(yǎng)于無菌條件下，從正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的胎盤臍帶面的羊膜中分M-MSCs 細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果如圖 1-1 所示，hAM-MSCs 原代細(xì)胞（壁生長，呈長梭形。hAM-MSCs 細(xì)胞傳至第 3 代（P3）時，形態(tài)為長梭長緊密，有偽足，排列整齊。

圖 1-2 hAM-MSCs 表面標(biāo)志物的鑒定Figure 1-2 Identification of hAM-MSCs surface markers. 免疫熒光檢測 hAM-MSCs 表面抗原 Vimentin 和 SSEA-4 的表達(dá)對第 3 代 hAM-MSCs 細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色檢測細(xì)胞表面標(biāo)記蛋mentin 和 SSEA-4 的表達(dá)。結(jié)果如圖 1-3，DAPI 染色顯示，hAM-MSCs 胞核被 DAPI 染成藍(lán)色，且 Vimentin 和 SSEA-4 兩種表面抗原蛋白M-MSCs 細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá)。

圖 1-2 hAM-MSCs 表面標(biāo)志物的鑒定Figure 1-2 Identification of hAM-MSCs surface markers. 免疫熒光檢測 hAM-MSCs 表面抗原 Vimentin 和 SSEA-4 的表達(dá)對第 3 代 hAM-MSCs 細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色檢測細(xì)胞表面標(biāo)記蛋mentin 和 SSEA-4 的表達(dá)。結(jié)果如圖 1-3，DAPI 染色顯示，hAM-MSCs 細(xì)胞核被 DAPI 染成藍(lán)色，且 Vimentin 和 SSEA-4 兩種表面抗原蛋白均M-MSCs 細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá)。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2756548