【摘要】：研究意義 隨著人口老齡化進(jìn)程的加速，老年變性性癡呆已成為日益嚴(yán)重的社會和醫(yī)療問題，對腦老化及癡呆的病理機(jī)制和防治研究受到高度重視。老齡腦和變性性癡呆患者腦具有相互重疊的病理和生化改變，提示腦老化是變性性癡呆的發(fā)病基礎(chǔ)，二者之間有相互聯(lián)系的分子機(jī)制。 新近出現(xiàn)的蛋白質(zhì)組學(xué)可以比較兩個或更多的樣品之間蛋白質(zhì)整體表達(dá)水平，是揭示疾病分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)志蛋白，尋找新的藥物靶標(biāo)的理想工具，也是生命科學(xué)進(jìn)入后基因組時代的標(biāo)志之一。由于技術(shù)水平限制或腦標(biāo)本較難得到等原因，目前僅有少量對阿爾茨海默病及老齡大腦進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析的報(bào)道。額顳葉癡呆是老年變性性癡呆的重要類型，但迄今尚沒有專門針對額顳葉癡呆的腦蛋白質(zhì)組學(xué)研究。大量證據(jù)顯示阿爾茨海默病患者的小腦病損輕微，因此對小腦的蛋白質(zhì)表達(dá)深入研究或許可以幫助我們揭示腦老化及變性癡呆的分子機(jī)制，但迄今亦沒有專門針對老齡小腦的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。 本文采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對老齡人腦、額顳葉癡呆患者腦進(jìn)行研究，旨在發(fā)現(xiàn)腦老化及額顳葉癡呆相關(guān)蛋白質(zhì)，以深入理解腦老化及額顳葉癡呆分子機(jī)制。并為尋找早期診斷治療額顳葉癡呆的有效方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法 經(jīng)病理證實(shí)的額顳葉癡呆患者及正常老年人尸檢腦標(biāo)本均取自解放軍總醫(yī)院。腦組織經(jīng)蛋白提取、第一向等電聚焦電泳、第二向垂直SDS-PAGE電泳后、以銀染或考馬斯亮蘭R250顯色。透射掃描雙向電泳凝膠，所得圖譜以ImageMaster 2D Elite軟件進(jìn)行圖像分析。將感興趣蛋白質(zhì)點(diǎn)從考馬斯亮蘭染色的凝膠上切下，膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解。以MALDI-TOF質(zhì)譜或MALDI-TOF／TOF串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索 博士學(xué)位論文 摘要 對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定. 研究內(nèi)容 I老年人小腦組成蛋白質(zhì)組初步研究 選取3例正常老年人小腦組織為研究對象，進(jìn)行了小腦蛋白質(zhì)雙向 電泳展示，以生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定了表達(dá)量較高的88個蛋白質(zhì)，包括中間 代謝酶類，細(xì)胞骨架蛋白、杭氧化蛋白、神經(jīng)元特異蛋白、信號蛋白等. 初步建立了老年人小腦蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫. 11不同年齡人小腦比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究 針對人小腦蛋白質(zhì)在衰老過程中的差異表達(dá)進(jìn)行研究.老年人及成 年人、胎兒死亡后的小腦蛋白質(zhì)通過雙向電泳分離.使用ImageMasterZD 軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析:與成年人、胎兒小腦相比，老年人小腦蛋白 質(zhì)的雙向電泳凝膠圖譜上有5個蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)，8個蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào)。通 過質(zhì)譜鑒定，在老年人小腦中，谷氨酸脫氮酶、肌酸激酶前體、膠質(zhì)纖 維酸性蛋白、Mn超氧化物歧化酶、a一烯醉化酶表達(dá)上調(diào).而碳酸脫水 酶、二氮喻吮酶相關(guān)蛋白2、果糖二磷酸醛縮酶人、丙酮酸激酶、谷氮酞 胺合成酶、血紅蛋白表達(dá)下調(diào). 111人小腦與領(lǐng)葉的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析 取4例老年人腦及1例中年人腦，將其額葉及小腦蛋白用雙向電泳 進(jìn)行展示.3個蛋白質(zhì)在小腦表達(dá)量增加，被分別鑒定為杭氧化蛋白2、 肌酸激酶前體(線拉體)、果糖二磷酸醛縮酶C.另外5個蛋白質(zhì)點(diǎn)在額 葉表達(dá)童增加.我們還鑒定了30個表達(dá)量在額葉及小腦沒有顯著變化的 蛋白質(zhì).這些被鑒定的蛋白質(zhì)包括一些重要的酶類和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)如超氧 化物歧化酶、硫氧還蛋白過氧化物酶、烏頭酸水化酶、烏頭酸酶2、3- 磷酸甘油醛脫氫酶、co f 1 1 in、膚酞-脯氨酞一順反異構(gòu)酶A、血清白蛋白 前體、二氫啥吮酶相關(guān)蛋白2、a一烯醇化酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、蘋果 4 博士學(xué)位論文 摘要 酸脫氮酶等.進(jìn)一步豐富了人腦蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。 w領(lǐng)瀕葉癡呆的蛋白質(zhì)組研究 選取5例經(jīng)病理證實(shí)的額瀕葉癡呆患者與4例正常老年人尸檢腦標(biāo) 本進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.18種蛋白質(zhì)的表達(dá)量在額瀕葉癡呆患者與 正常老年人顯著不同.12個在額瀕葉癡呆表達(dá)量上調(diào)的蛋白質(zhì)被鑒定為 3一磷酸甘油醛脫氮酶、尿喀吮DNA糖普水解酶、Cu一Zn超氧化物歧化酶、 異檸稼酸脫氮酶亞單位、5 ynaptotagminl、peroxiredoxinZ、膠質(zhì)纖 維酸性蛋白、P25 a1Pha、烯酸輔酶A水合酶短鏈1、咄哆醉一5，-磷酸氧 化酶、Mn超氧化物歧化酶、a一烯醇化酶;6個在額顏葉癡呆表達(dá)量下調(diào) 的蛋白質(zhì)被鑒定為杭氧化蛋白2(酸性鈣離子依賴型磷脂酶A)、鐵蛋白 H鏈、谷氛酸脫氮酶、膚基脯氛酸順反異構(gòu)酶A、血清白蛋白前體、二氫 喻吮酶相關(guān)蛋白2. V蛋白質(zhì)組技術(shù)鑒定氧化修飾蛋白質(zhì) 氧化修飾蛋白質(zhì)在腦老化及變性性癡呆的發(fā)病機(jī)制中起主要作用. 本研究旨在建立以雙向電泳結(jié)合we 5 ternblotting及質(zhì)譜技術(shù)分離、鑒 定人腦氧化修飾蛋白質(zhì)的方法.第一向等電聚焦后，IPG膠條同二稍基 苯拼(洲PH)反應(yīng)，然后行第二向SDs一AGE電泳.兩張平行凝膠中的一 張行考馬斯亮蘭染色，另一張凝膠上蛋白質(zhì)點(diǎn)電轉(zhuǎn)移至PvDF膜，PvDF 膜同抗一DNP杭體反應(yīng)，HRP二抗標(biāo)記，DAB顯色.同PvDF膜上顯色點(diǎn)相 對應(yīng)的考染凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)即為氧化修飾蛋白質(zhì).以質(zhì)譜鑒定了兩個 氧化修飾蛋白質(zhì)一p-肌動蛋白和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶. 研究結(jié)論以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)新發(fā)現(xiàn)了一?
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R749.16
【圖文】：

理論分子量、等電點(diǎn)、Swiss一Prot數(shù)據(jù)庫序列號、蛋白質(zhì)鑒定分?jǐn)?shù)以及膚段覆蓋率等信息見表1.圖1的1號蛋白點(diǎn)經(jīng)胰蛋白酶膠內(nèi)酶切，在MALDI一TOF質(zhì)譜儀上得到的特征性的多膚質(zhì)量譜及利用Mas。ot公司提供的免費(fèi)的膚質(zhì)量指紋圖譜檢索軟件鑒定為杭氧化蛋白2的過程見圖2(人一C).1號蛋白點(diǎn)以MALDI一TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)被鑒定為抗氧化蛋白2的過程見圖3(A一D):首先在第1級質(zhì)譜得到膚片段質(zhì)量指紋圖譜，選擇其中質(zhì)量電荷比(m/z)為1200.75的膚段經(jīng)離子化后進(jìn)入第2級質(zhì)譜分析儀，分析出該膚段的氨基酸序列為vvlsLQI江AEK。膚質(zhì)童指紋圖譜與膚序列信息一起用來檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，鑒定出蛋白質(zhì).圖1的28號蛋白點(diǎn)被鑒定為膠質(zhì)纖維酸性蛋白的過程見圖4、圖5.

圖3MALDI一TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀鑒定1號蛋白點(diǎn)為杭氧化蛋白2的過權(quán)Fig3.Ideniificationofspotlas“Antio石d別吐protein2’’byta口demMSanddati山。義se即陷hing.A.l級質(zhì)譜分析儀得到的經(jīng)膠內(nèi)酶切的l號蛋白點(diǎn)肚質(zhì)量指紋譜A.MLALDI.TOFMSPePtidemassfingerprintsPectl”mobtainedfromcrudepepti(l。mix奴ireafterin-geltryPtiedigestofsPotNo.lB.2級質(zhì)譜分析儀對m龍】200.75肚段的分析B.LiftMsMsspectrUmofPrecursorionatn口之1200·75obtainedduringtheanaly“l(fā)”ofsPot1inAC.推導(dǎo)出氨基酸序列VVISLQLI’AEKC.Theaminoacid父quenceofVVISLQIJ人EKwasdedueed.D.被鑒定為抗氧化蛋白2，標(biāo)下劃線者為匹配膚段.D.TheProteinwasidentifiedas‘，AniioxidantProteinZ，，.MatchedpePti，~··、、’shownunderiined.

圖SM^Lnl一TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀對28號蛋白點(diǎn)m/21277.74KDa膚段氨基酸序列分析

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 何大澄,肖雪媛;差異蛋白質(zhì)組學(xué)及其應(yīng)用[J];北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2002年04期

本文編號：2743430