【摘要】： 目的 PTSD——創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder,PTSD)是對創(chuàng)傷等嚴(yán)重刺激因素的一種異常精神反應(yīng)。是指由突發(fā)性、威脅性或?yàn)?zāi)難性生活事件導(dǎo)致個體延遲出現(xiàn)和長期持續(xù)存在的精神障礙,其臨床表現(xiàn)以再度體驗(yàn)創(chuàng)傷為特征,并伴有情緒的易激惹和回避行為。現(xiàn)今因其發(fā)病率高、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn)而備受關(guān)注。PTSD患者表現(xiàn)出海馬體積縮小、血液中的皮質(zhì)酮基礎(chǔ)水平較低以及對應(yīng)激反應(yīng)性降低。另有研究報道,心理疾病患者出現(xiàn)糖皮質(zhì)激素(glucoticold,GC)負(fù)反饋功能反常,發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重抑郁癥患者的GC反饋功能降低而PTSD患者的GC反饋功能增強(qiáng)。這些數(shù)據(jù)提示PTSD患者的下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA-axis)功能反常。 在GC反饋調(diào)節(jié)過程中可受到鹽皮質(zhì)激素受體(MinealocorticoidReceptor,MR)和糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid Receptor,GR)的雙重調(diào)節(jié)。在HPA軸中,這兩種受體通過影響GC的負(fù)反饋而發(fā)揮重要作用。這兩種受體與皮質(zhì)酮的親和力不同,MR是高親和力和低容量的GC受體系統(tǒng),而GR為低親和力和高容量的GC受體系統(tǒng)。此外,兩種受體在機(jī)體內(nèi)的分布亦不同,MR主要分布于腦邊緣結(jié)構(gòu)內(nèi):如海馬、杏仁核和額葉皮質(zhì)細(xì)胞群,而GR廣泛分布于所有腦區(qū)。推測兩種受體可能在PTSD中行使不同的功能。研究發(fā)現(xiàn)了在精神障礙性疾病中MR和GR媒介效應(yīng)的重要性,這些受體可調(diào)節(jié)與記憶、行為反應(yīng)、害怕和恐懼相關(guān)的系統(tǒng)。MR是抑制HPA的重要控制因素,當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激后,MR與皮質(zhì)酮結(jié)合的效應(yīng)逐漸被GR所取代。因此,增加MR的容量可以降低對應(yīng)激的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)。如抗抑郁藥物可增加海馬MR的表達(dá)以及降低HPA軸的基礎(chǔ)活性和應(yīng)激誘導(dǎo)活性,阻斷MR和GR使機(jī)體產(chǎn)生焦慮和驚恐、MR拮抗劑可使恐懼增強(qiáng)。這些研究表明,海馬MR和GR的變化能調(diào)節(jié)精神障礙疾病的行為和情緒變化。另一方面,過多的皮質(zhì)醇激素或慢性缺失都使海馬神經(jīng)元發(fā)生改變,提示皮質(zhì)醇激素受體是海馬損傷的重要因素。研究報道,通過應(yīng)用MR配體可以治療突觸功能的退化和丟失,因此MR和GR對海馬神經(jīng)元發(fā)生的效應(yīng)暗示在PTSD中MR、GR均是改變海馬結(jié)構(gòu)和功能的重要因素。 此外,臨床檢查也發(fā)現(xiàn)PTSD患者血中糖皮質(zhì)激素水平低下的同時血中的促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)和精氨酸加壓素(arginine vasopressin,AVP)濃度反而增高。下丘腦作為HPA軸中重要中樞部位,即決定著血中皮質(zhì)酮的改變,同時也受到海馬的負(fù)反饋抑制,因此海馬功能的變化勢必要影響下丘腦的改變,血中皮質(zhì)醇濃度的變化也可能影響下丘腦的改變。并且MR在下丘腦中不受皮質(zhì)醇的調(diào)節(jié),提示下丘腦內(nèi)MR不直接涉及HPA軸的功能。因此認(rèn)為MR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有雙重角色,在海馬MR調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇晝夜變化的基礎(chǔ)水平,而在下丘腦中只影響鹽皮質(zhì)激素對鹽離子吸收和調(diào)節(jié)血壓。GR作為糖皮質(zhì)激素效應(yīng)的執(zhí)行者,不僅參與機(jī)體的能量代謝,而且還對多種基因具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,并直接接受激素的反饋調(diào)節(jié)。此外,當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激刺激時,下丘腦室旁核(Paraventricular nucleus,PVN)的神經(jīng)元分泌多種促進(jìn)促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropic hormone,corticotropin,ACTH)分泌的激素,其中最常見的是CRH和AVP。這兩種激素可進(jìn)一步調(diào)節(jié)血中類固醇激素的水平。 綜上所述,海馬富有MR和GR兩種受體,MR和GR作為類固醇激素的受體,可調(diào)節(jié)PTSD患者血中類固醇激素水平,同時又能影響海馬對下丘腦的作用。并且海馬又是與記憶相關(guān)的結(jié)構(gòu),可見其結(jié)構(gòu)和功能改變與PTSD的恐懼、麻木等精神癥狀表現(xiàn)有著必然的聯(lián)系,因此海馬與下丘腦是與PTSD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的部位。另外,文獻(xiàn)報道:目前SPS(Single prolonged stress)方法能很好地反映PTSD的激素水平變化,是制作PTSD動物模型的理想方法,并且該方法已經(jīng)被國際所確認(rèn)。因此本研究采用SPS方法刺激大鼠使產(chǎn)生PTSD樣改變,然后應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫雙標(biāo)技術(shù)和Western blotting技術(shù)研究SPS刺激后各時間段的海馬、下丘腦內(nèi)MR和GR的表達(dá)以及下丘腦內(nèi)CRH和AVP的表達(dá),探討海馬與HPA的相互影響,為揭示PTSD的發(fā)病機(jī)制和臨床表現(xiàn)的研究提供依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 1、模型制作及分組 采用2005年日本文部省召開的國際PTSD科學(xué)會議確定的關(guān)于大鼠PTSD模型-SPS。其具體方法是將大鼠連續(xù)進(jìn)行下述步驟處理:固定刺激(Immobilization)2h;強(qiáng)迫性游水(Forced swimming)20 min(水深40cm,水溫25℃);乙謎麻醉(Ether anesthesia)暈倒后停止麻醉;無干擾空間(Undisturbed)常規(guī)喂養(yǎng)。隨機(jī)分為4組,即對照組及SPS后24h、7d、14d。 2、海馬MR、GR和下丘腦MR、GR、CRH及AVP的免疫組織化學(xué)方法 分別選取各組大鼠固定、沉糖的大腦,制作冰凍切片,確定海馬、下丘腦的部位后分別用SAβC法進(jìn)行海馬的MR、GR,下丘腦的MR、GR免疫組織化學(xué)染色(工作濃度:MR1:300;GR1:800)及下丘腦CRH和AVP染色(工作濃度:CRH1:500;AVP1:1000),DAB顯色,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS,BX60,Japan)下觀察,攝片。 3、Western Blotting檢測海馬、下丘腦MR、GR和CRH 分別取新鮮海馬和下丘腦組織經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心,提取上清蛋白,電泳,轉(zhuǎn)膜,經(jīng)封閉后分別加一抗MR、GR、CRH(MR工作濃度1:500,GR工作濃度1:1000;CRH工作濃度1:800;)4℃過夜;HRP標(biāo)記IgG(工作濃度1:1500)孵育2h,DAB法顯色,掃描各條帶計算光密度值。(由于AVP的分子量小,故本文為對其進(jìn)行Western Blotting檢測) 4、海馬MR和GR免疫熒光雙標(biāo)及共焦激光掃描顯微術(shù)觀察 取海馬冰凍切片,依次用PBS漂洗,5%BSA封閉20min后,滴加兔抗鼠GR(工作濃度為1:800),4℃孵育過夜,0.1M PBS漂洗,滴加羊抗兔的FITC-IgG,室溫2h,經(jīng)0.1M PBS漂洗后依次滴加正常兔血清IgG室溫2h,無標(biāo)記的Protein A(濃度為1mg/ml)室溫2h,兔抗鼠MR抗體(工作濃度為1:300),繼續(xù)4℃孵育過夜,PBS漂洗后滴加Protein A-Alexa 546,室溫2h,0.1mol/L PBS漂洗、封片,激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)下觀察,攝片。 結(jié)果 一、免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果: 1、海馬MR免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果: 低倍鏡下可見MR分布于海馬各個區(qū)域。分別取海馬CA1區(qū)于高倍鏡下觀察可見MR陽性表達(dá)產(chǎn)物根據(jù)細(xì)胞的功能狀態(tài)而呈現(xiàn)不同部位的表達(dá)分布,有的分布于胞核,有的可見表達(dá)于胞漿中,并于SPS后24h、7、14天MR的陽性表達(dá)亦持續(xù)降低。 2、海馬GR免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果: 低倍鏡下可見GR的陽性表達(dá)產(chǎn)物主要分布于海馬的CA1區(qū),高倍鏡下可見其主要集中分布于細(xì)胞核中,胞漿中相對較少。經(jīng)SPS后,24h時,可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的陽性表達(dá)減弱且突起縮短。7d、14d后,該處神經(jīng)元的GR的陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng),且突起逐漸延伸。 3、下丘腦室旁核MR免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果: 低倍鏡下觀察下丘腦室旁核小細(xì)胞性神經(jīng)元和大細(xì)胞性神經(jīng)元中均見MR的陽性表達(dá)產(chǎn)物分布。高倍鏡下觀察MR陽性表達(dá)主要集中于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中。但大鼠經(jīng)SPS處理后24h、7日、14日與對照組未見明顯差異。 4、下丘腦室旁核GR免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果: GR的陽性表達(dá)產(chǎn)物于低倍鏡下主要分布于下丘腦室旁核小細(xì)胞性神經(jīng)元,高倍鏡下觀察GR陽性表達(dá)的神經(jīng)元主要集中分布于細(xì)胞核中,胞質(zhì)中相對較少。SPS刺激后,24h時,可見下丘腦室旁核內(nèi)神經(jīng)元的GR陽性表達(dá)減弱,當(dāng)?shù)?日時,該處神經(jīng)元的GR的陽性表達(dá)增強(qiáng)且高于正常,而第14日時降低回復(fù)接近正常對照組。 5、下丘腦室旁核CRH免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果: 低倍鏡下可見下丘腦室旁核中CRH分布于大細(xì)胞神經(jīng)元的胞漿內(nèi),當(dāng)大鼠經(jīng)SPS處理后,24h、7d時胞漿內(nèi)CRH呈上升趨勢且均高于正常對照組,14d時有所恢復(fù)。 6、下丘腦室旁核AVP免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果: 高倍鏡下可見AVP的陽性表達(dá)產(chǎn)物主要分布于下丘腦室旁核中神經(jīng)元的胞體及突起中。經(jīng)SPS后,AVP的表達(dá)變化基本同于CRH,即24h、7d時呈現(xiàn)上升趨勢且7d時突起中可見明顯的串珠樣陽性產(chǎn)物,14d后,該處神經(jīng)元的AVP的陽性表達(dá)逐漸恢復(fù)。 二、Western blotting檢測結(jié)果 1、海馬MR Western blotting檢測結(jié)果 Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)SPS后24h、7d、14d時大鼠海馬MR的表達(dá)漸續(xù)下調(diào)。 2、海馬GR Western blotting檢測結(jié)果 Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)SPS后大鼠海馬GR的表達(dá)為24h降低、7d、14d時漸續(xù)回升。 3、下丘腦MR Western blotting檢測結(jié)果 Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)SPS后24h、7d、14d時大鼠下丘腦MR的表達(dá)未見明顯改變。 4、下丘腦GR Western blotting檢測結(jié)果 Western blotting檢測顯示SPS后24h時GR的表達(dá)降低,7d時升高且超過正常,至14d時又降低接近正常。 5、下丘腦CRH Western blotting檢測結(jié)果 Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)SPS后大鼠下丘腦內(nèi)CRH逐漸升高,7d最高,14d時回調(diào)。 三、海馬CA1區(qū)MR和GR免疫熒光雙標(biāo)記 標(biāo)本在CLAM下觀察,MR-Alexa被543nm波長激發(fā)為紅色光,GR-FITC被488nm波長激發(fā)為綠色光,二者融合為黃色或橙色光。對照組可見MR分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,GR主要分布于細(xì)胞核中,少數(shù)見于細(xì)胞質(zhì)中;SPS-24h時MR主要集中于細(xì)胞質(zhì)中,而細(xì)胞核中分布減少,GR未見明顯改變;SPS-7d時MR在細(xì)胞核中表達(dá)進(jìn)一步減少,GR的主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,偶爾見于細(xì)胞核內(nèi);SPS-14d時MR仍然集中于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),而GR在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)減少而細(xì)胞核中的表達(dá)明顯增加。用雙重波長激發(fā)時,則可見到兩種熒光同時出現(xiàn),顯示兩光融合而成的黃色或橙色光。對照組該融合光主要集中分布于細(xì)胞核,SPS-24h組中細(xì)胞核內(nèi)融合光減弱,當(dāng)7d時二者融合光主要集中分布于細(xì)胞質(zhì)中,到14d時二者融合光又重新集中于細(xì)胞核而細(xì)胞質(zhì)中減少。 結(jié)論 1、海馬CA1區(qū)鹽皮質(zhì)激素受體(MR)在PTSD中呈現(xiàn)逐步下降趨勢,提示PTSD出現(xiàn)的血中糖皮質(zhì)激素(GC)水平較低與海馬MR密切相關(guān)。證實(shí)了海馬對下丘腦的負(fù)反饋抑制作用。同時也表明MR與PTSD樣大鼠的恐懼相關(guān)。 2、海馬CA1區(qū)糖皮質(zhì)激素受體(GR)在PTSD中呈現(xiàn)出現(xiàn)降低再恢復(fù)現(xiàn)象,提示其可能與PTSD的GC水平改變相關(guān)。 3、海馬CA1區(qū)MR/GR比值下降提示MR/GR與PTSD海馬損傷相關(guān)。 4、下丘腦MR與PTSD皮質(zhì)醇激素水平調(diào)節(jié)的相關(guān)性不顯著。 5、下丘腦GR表達(dá)先降低后回調(diào),提示下丘腦內(nèi)GR水平受海馬的影響,進(jìn)而調(diào)控CRH和AVP的變化,影響PTSD皮質(zhì)醇激素水平的變化。 6、下丘腦CRH和AVP同時表現(xiàn)為上調(diào)趨勢,提示CRH在AVP的協(xié)同下調(diào)節(jié)PTSD皮質(zhì)醇激素水平,并且與PTSD的神經(jīng)精神癥狀的臨床表現(xiàn)相關(guān)。 7、核受體MR、GR在海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)受PTSD大鼠血漿皮質(zhì)醇濃度變化影響,并且導(dǎo)致海馬受損、功能降低。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R749.5
【圖文】：

1、MR的結(jié)果 Westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)SpS后24h、7d、14d時大鼠海馬MR的表達(dá)漸續(xù)下調(diào)(圖1一3)。e愉trols玲 -24hSPS一7ds護(hù)S一14d欲卜鉀，一一p一 aetin圖1一3，MR的 westemblotting檢測結(jié)果2、GR的結(jié)果 Westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)SPS后大鼠海馬GR的表達(dá)為24h降低、7d、14d時

B正常對照組海馬CAI區(qū)神經(jīng)元中GR的染色;C大鼠經(jīng)SPS后24h時，海馬CAI區(qū)神經(jīng)元中GR的染色;D大鼠經(jīng)SPS后7天時，海馬CAI區(qū)神經(jīng)元中GR的染色;E大鼠經(jīng)SPS后14天時，海馬CAI區(qū)神經(jīng)元中GR的染色.(X4OO)二、 WesternB1ott1ng的結(jié)果1、MR的結(jié)果 Westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)SpS后24h、7d、14d時大鼠海馬MR的表達(dá)漸續(xù)下調(diào)(圖1一3)。e愉trols玲 -24hSPS一7ds護(hù)S一14d欲卜鉀，一一p一 aetin圖1一3，MR的 westemblotting檢測結(jié)果2、GR的結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】

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1 張彥慧;韓芳;石玉秀;;穹窿切斷后海馬神經(jīng)元GR表達(dá)變化的研究[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2006年06期

2 劉虹;韓芳;石玉秀;;穹窿切斷對大鼠下丘腦CRH表達(dá)的影響[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2006年06期

3 杜U

本文編號：2741784