【摘要】：目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年人中最常見的一種癡呆癥,p淀粉樣肽(Amyloid β-peptide,Aβ)的異常聚集和AD的發(fā)病密切相關(guān)。研究表明 2 型髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)可能通過增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能來參與Aβ的清除。炎癥反應(yīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞的功能與AD的發(fā)病進(jìn)程密切相關(guān)。TREM2主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等髓系細(xì)胞。全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)發(fā)現(xiàn),TREM2基因的一些突變會顯著增加AD的患病風(fēng)險(xiǎn),但是其作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討TREM2及突變體在AD的進(jìn)程中的作用。方法:(1)用電化學(xué)發(fā)光(meso scale discovery,MSD)方法檢測不同年齡的AD模型小鼠(APP/PS1)和野生型小鼠(WT)腦組織內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)量的變化。(2)用組織多色免疫熒光標(biāo)記技術(shù)檢測小鼠腦組織切片內(nèi)Aβ和TREM2的表達(dá)情況。(3)用Western blot方法檢測不同年齡的AD模型小鼠(APP/PS1)和野生型小鼠(WT)腦組織內(nèi)TREM2、Aβ和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(Iba-1)表達(dá)量的變化。(4)利用Spearman分析的方法,對AD模型小鼠(APP/PS1)腦組織內(nèi)Aβ、TREM2和細(xì)胞因子表達(dá)量的變化進(jìn)行相關(guān)性分析。(5)用PCR和全外顯子測序的方法從漢族AD患者外周血標(biāo)本中篩選TREM2基因突變。(6)用pEGFP-N1載體構(gòu)建3個(gè)TREM2及突變體表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。(7)通過Western blot和雙抗體夾心ELISA方法檢測并分析突變對TREM2表達(dá)水平、細(xì)胞內(nèi)代謝、糖基化修飾及細(xì)胞活力的影響。(8)用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力,并根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果:(1)MSD結(jié)果表明,相同周齡下,與野生型(WT)小鼠相比,AD模型小鼠(APP/PS1)腦組織內(nèi)的細(xì)胞因子(TNF-a,IL-1β,IL-6,IL-12,IL-4 和 IL-10)表達(dá)水平未見顯著差異。(2)多色免疫熒光和Western blot結(jié)果表明,相同年齡下,與野生型(WT)小鼠相比,AD模型小鼠(APP/PS1)腦組織內(nèi)Aβ(Aβ斑塊,Aβ寡聚體和 Aβ42)的表達(dá)量顯著增加(APP/PS1:43.52±8.8,WT:19.6±2.55,p0.05);在APP/PS1小鼠中,Aβ的表達(dá)量隨年齡增長而增加;在16w以上的APP/PS1小鼠中,TREM2的表達(dá)量隨年齡增加,24 w與3 w相比顯著增加(3 w:2.22±0.71,24w:5.45±1.28,p0.05);與WT小鼠相比,在APP/PS1小鼠中,小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 Iba-1 的表達(dá)量在 16 w 時(shí)顯著增加(APP/PS1:0.0446±0.0126,WT:0.0212±0.0062,p0.05)。(3)AD模型小鼠(APP/PS1)腦組織中TREM2分別與細(xì)胞因子(TNF-α和IL-1β)、Aβ(Aβ寡聚體和Aβ42)之間顯著正相關(guān)(TNF-α和IL-1β與 Aβ 相關(guān)系數(shù) r0.5,p0.05;TNF-α 和 IL-1β 與 TREM2 相關(guān)系數(shù) r0.5,p0.05;TREM2與Aβ相關(guān)系數(shù)r0.5,p0.01)。(4)通過PCR和全外顯子測序,從漢族AD患者外周血標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)TREM2突變p.A192T。(5)Western blot結(jié)果顯示,TREM2-FL-EGFP的主要條帶位于50kDa附近,TREM2-CTF-EGFP的主要條帶位于35 kDa附近。糖基化的TREM2條帶則位于50～80 kDa之間。與TREM2-WT相比,TREM2-R47H突變組,總蛋白中TREM2和上清中sTREM2中表達(dá)量顯著升高(WT:621±158.99,R47H:1178.78±102.05,P0.05),糖基化修飾沒有顯著變化;與TREM2-WT相比,TREM2-A192T突變組,上清中sTREM2表達(dá)量顯著性增加(WT:621±158.99,A192T:832.11±110.67,P0.05);糖酶處理后殘余的糖基化條帶顯著增加(WT:0.22±0.27,A192T:0.81±0.23,p0.05);細(xì)胞存活率顯著增強(qiáng)(WT:32.53±2.03,A192T:65.6±12.66,p0.05)。結(jié)論:(1)篩選出漢族AD患者TREM2基因突變p.A192T,并構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒。(2)AD模型小鼠腦組織TREM2表達(dá)水平分別與炎癥細(xì)胞因子(TNF-α和IL-1 β)和病理性Aβ含量成正相關(guān),表明TREM2可能通過炎癥反應(yīng)參與AD的進(jìn)程。(3)在HEK293細(xì)胞中,A192T突變增加了 sTREM2表達(dá)水平,并與TREM2糖基化修飾的改變相關(guān),可以提高細(xì)胞存活率。提示其與降低細(xì)胞存活率的AD進(jìn)程無明顯關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R749.16

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本文編號：2738132