【摘要】：Tau蛋白是功能性的結構不對稱磷蛋白,屬于微管蛋白(Microtubule associated protein, MAP),其作用是起到穩(wěn)定腦內神經細胞軸突微管的空間立體結構,從而保持神經細胞軸突微管之間的距離合適,保證神經遞質等介質在神經細胞軸突的正常運輸。神經細胞正常生理功能的調節(jié)主要是由Tau蛋白的磷酸化程度決定的,正常磷酸化的Tau蛋白起到穩(wěn)定神經細胞軸突微管的功能,而過度磷酸化的Tau蛋白能使微管立體空間發(fā)生不穩(wěn)定變化,微管的正常裝配過程受到抑制,最終導致大多數神經細胞的遞質傳遞障礙,引起機體發(fā)生學習和記憶功能障礙。胎兒宮內窘迫后可出現學習記憶功能受損的原因,可能是與神經組織內異常的谷氨酸(Glutamic acid, Glu)信息傳遞系統(tǒng)有關,Glu信息傳遞異�？梢砸鹕窠浖毎膽し磻�,導致海馬組織廣泛的長時程增強效應(long-term potentiation, LTP)飽和狀態(tài),造成神經細胞突觸可塑性障礙。Glu及其受體參與了神經細胞的突觸傳遞興奮性,與學習和記憶有關；一旦Glu過度興奮可引起神經細胞的快速去極化,去極化的結果會引起Cl-、Na+、H2O和Ca2+大量內流,導致神經細胞內Ca2+超載,通過磷酸肌醇環(huán)路的激活破壞神經細胞的超微結構,最終導致神經細胞溶解、凋亡或死亡。N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-d-aspartic acid receptor, NMDAR)拮抗劑5-甲基二氫丙環(huán)庚烯亞胺馬來酸(MK-801)和使君子酸受體(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazole-4-propionic acid receptor,AMPA R)拮抗劑純品二硝基喹酮(DNQX)作為Glu受體(GluR)的有效拮抗劑,可降低由冷水刺激引起的Tau蛋白磷酸化的水平,說明強應激可以通過Glu信息傳遞系統(tǒng)的激活來調節(jié)Tau蛋白磷酸化的程度,影響神經細胞的興奮性傳遞系統(tǒng)。海馬組織內Tau蛋白的過度磷酸化的原因可能是由于強應急引起的Glu信息傳遞系統(tǒng)的過度激活造成的。胎兒宮內窘迫的主要原因是宮內胎兒的血供絕對或相對下降引起的,造成胎兒出生后學習和記憶等腦功能下降,但其具體的發(fā)病機制不明。由于血供不足引起的缺血缺氧強應激是否會引起的Glu信息傳遞系統(tǒng)異常,導致Tau蛋白過度磷酸化,造成學習記憶等腦功能障礙?假如是,那GluR阻滯劑和具有GluR阻滯作用的藥物可否逆轉此過程?第一部分不同程度和時間阻斷子宮動脈對鼠海馬組織內Glu的濃度的影響目的：觀察不同程度和時間阻斷子宮動脈的宮內窘迫干預對胎鼠海馬Glu濃度的影響。方法：建立宮內窘迫的大鼠模型,采用3×3析因設計：阻斷子宮動脈的程度(3水平：輕度阻斷、中度阻斷、完全阻斷)和阻斷時間(3水平：5min.10min.15 min)的所有組合。隨機將72只大鼠分為9個組(n=8)：LL組(輕度阻斷,5min)lLM組(輕度阻斷,10min);LH組(輕度阻斷,15 min);ML組(中度阻斷,5min);MM組(中度阻斷,10 min);MH組(中度阻斷,15 min);HL組(完全阻斷,5 min);HM組(完全阻斷,10min)；HH組(完全阻斷,15 min)。全部胎兒宮內窘迫制模結束后,剖宮取出胎鼠,留取海馬,高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)檢測Glu在海馬中的含量。結果：宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激誘發(fā)海馬Glu濃度升高：在宮內窘迫造模中,子宮動脈的阻斷程度和阻斷時間均可明顯影響這一過程,兩者作用疊加。結論：本實驗發(fā)現宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激后胎鼠海馬組織內Glu濃度明顯升高,而且海馬組織中Glu濃度隨阻斷子宮動脈的程度和阻斷時間而增加。提示我們在臨床治療中應積極改善子宮動脈的供血,可減輕胎兒宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激后的胎兒機體神經細胞損傷。第二部分NMDA受體拮抗劑和AMPA受體拮抗劑對宮內窘迫后新生鼠學習記憶障礙和Tau蛋白過度磷酸化的影響目的：通過對GluR拮抗劑對宮內窘迫后新生鼠學習記憶能力和對Tau蛋白過度磷酸化程度觀察,分析GluR拮抗劑對新生鼠學習記憶能力的影響及其可能機制的分析。方法：采用2×3析因設計：宮內窘迫是和否(2水平：否、宮內窘迫即中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)和GluR拮抗劑使用和否(3水平：注射生理鹽水、NMDA受體拮抗劑MK-801、AMPA受體拮抗劑DNQX)的所有組合。隨機將48只孕鼠隨機6個實驗組(n=8)：S組(經尾靜脈注射2m1生理鹽水)、M組(經尾靜脈注射2ml NMDA受體拮抗劑MK-8015 mg/kg)、D組(經尾靜脈注射2ml AMPA受體拮抗劑DNQX 5 mg/kg)、SE組(經尾靜脈注射2 ml生理鹽水+施行宮內窘迫即中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)、ME組(經尾靜脈注射2 ml NMDA受體拮抗劑MK-8015 mg/kg+施行胎兒宮內窘迫即中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)、DE組(經尾靜脈注射2 ml AMPA受體拮抗劑DNQX 5 mg/kg+施行胎兒宮內窘迫即中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)。全部宮內窘迫處置結束后母鼠繼續(xù)妊娠至足月,剖宮娩出新生鼠,待新生鼠生長至12W時進行Morris水迷宮(Morris water maze, MWM)檢測學習記憶能力,檢測后麻醉下處死新生鼠留取海馬組織。高效液相色譜法(HPLC)法檢測Glu在海馬組織內的濃度；免疫組化SP (immunohistochemistry, IHC-SP)法檢測Tau蛋白5(總Tau蛋白)以及磷酸化Tau蛋白p-PHF1Ser396/404、p-AT8Ser199/202、p-12E8Ser262在海馬組織中的表達狀況。結果：宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激可以造成實驗新生鼠學習和記憶等腦功能障礙,即延長受試者的逃避潛伏期(escape latency,EL)、縮短受試者的空間探索時間(space exploration time, SET);宮內窘迫可明顯增加海馬組織中Glu的濃度；Glu受體的兩種拮抗劑對海馬組織內的Glu濃度沒有顯著的影響。宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧和Glu受體的拮抗劑對海馬組織內的總Tau蛋白表達沒有明確影響。胎兒宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧可增加海馬組織中磷酸化Tau蛋白的表達；Glu受體拮抗劑可緩解海馬組織內的Tau蛋白的過度磷酸化。結論：Glu受體的拮抗劑可以緩解胎兒宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激后的神經細胞損傷,其具體機制和阻斷興奮性毒性和緩解海馬組織內Tau蛋白的超磷酸化程度有關。第三部分宮內窘迫后新生鼠學習記憶障礙的預防措施實驗一：黃芪總苷對宮內窘迫后新生鼠海馬組織中G1u濃度的影響目的：通過觀察黃芪總苷對宮內窘迫模型后新生鼠海馬組織內Glu濃度的影響。方法：按2×2析因設計設置：宮內窘迫是否(2水平：否、施行宮內窘迫即中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)和黃芪總苷有無(2水平：尾靜脈注射5 ml生理鹽水或5 ml黃芪總苷40 mg/kg)的所有組合。40只24 W健康雌性SD大鼠建立宮內窘迫模型,建模結束后母鼠繼續(xù)妊娠至新生鼠娩出,待新生鼠生長至12W時將32只新生鼠隨機分為4個實驗組(n=8)：S組(尾靜脈注射5 ml生理鹽水)、P組(尾靜脈注射5 ml黃芪總苷40 mg/kg)、SE組(尾靜脈注射5 ml生理鹽水+中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)、PE組(尾靜脈注射5 ml黃芪總苷40 mg/kg+中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)1Omin)。全部宮內窘迫處置結束后母鼠繼續(xù)妊娠至足月,剖宮娩出新生鼠,待新生鼠生長至12W進行Morris水迷宮檢測,檢測結束后取新生鼠的海馬組織。使用HPLC檢測在新生鼠海馬組織中Glu的含量。結果：胎兒宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激可明顯增加新生鼠海馬組織中神經遞質Glu的濃度；黃芪總苷可降低宮內窘迫后新生鼠海馬組織中Glu的濃度。結論：胎兒宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激造成海馬組織內Glu濃度過度升高,進而誘發(fā)學習記憶功能障礙,而黃芪總苷則可通過降低海馬組織內過度升高的Glu濃度,從而改善胎兒宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激后的學習記憶能力。實驗二：黃芪總苷和NMDA受體拮抗劑對宮內窘迫后新生鼠學習記憶障礙比較研究目的：通過觀察黃芪總苷和NMDA受體拮抗劑MK-801對宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激后新生鼠Tau蛋白過度磷酸化的影響,探討兩者對Tau蛋白超磷酸化的調節(jié),為臨床治療提供理論依據。方法：采用2×3析因設計：宮內窘迫是否(2水平：否、中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)和藥物(3水平：尾靜脈注射生理鹽水、NMDA受體拮抗劑MK-801、黃芪總苷)的所有組合。隨機48只宮內窘迫模型大鼠隨機分為6組(n=8)：I組(5 ml生理鹽水iv)；II組(5m1MK-801 ⅳ,10mg/kg);Ⅲ組(5m1黃芪總苷ⅳ,200mg/kg);Ⅳ組(5 ml生理鹽水iv+中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)；V組(5 ml MK-801 ⅳ, 10mg/kg+中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min);Ⅵ組(5ml黃芪總苷iv,200 mg/kg+中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)。宮內窘迫處置結束后母鼠繼續(xù)妊娠至足月,剖宮娩出新生鼠,待新生鼠生長至12W時麻醉下斷頭取海馬,HPLC法檢測海馬組織中的Glu的含量,IHC-SP法檢測海馬組織中p-AT8Ser202和GSK-3β1H8的表達。結果：宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激可明顯增加海馬組織內神經遞質Glu的濃度；黃芪總苷可降低宮內窘迫后海馬組織內Glu濃度；而MK-801對海馬組織中Glu的濃度無明顯影響。宮內窘迫可增加海馬組織內超磷酸化的Tau蛋白p-AT8Ser202以及促進Tau蛋白過度磷酸化的調控蛋白GSK-3β1H8的表達；黃芪總苷和MK-801效果相似均可緩減海馬組織內p-AT8Ser202及促進其磷酸化的GSK-3β1H8表達,且和宮內窘迫的影響呈相減效果。結論：黃芪總苷可以通過降低海馬Glu濃度減緩Tau蛋白的磷酸化；GSK-3β是該信號通路的關鍵蛋白；黃芪總苷改善宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激后的學習記憶能力的效果優(yōu)于MK-801。實驗三：黃芪總苷、人參皂苷Rg-1、蛋白磷酸酯酶-2A和氯化鋰對宮內窘迫后新生鼠海馬組織Glu濃度的影響目的：觀察黃芪總苷、人參皂苷Rg-1、蛋白磷酸酯酶-2A和氯化鋰對宮內窘迫后新生鼠海馬內Glu濃度和的影響。方法：采用2×5析因設計：宮內窘迫是否(2水平：否、中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)和藥物干預(5水平：通過子宮動脈微量注射生理鹽水、黃芪總苷、人參皂苷Rg-1、蛋白磷酸酯酶-2A、氯化鋰,20μ g·1 μ L-1)的所有組合。隨機將80只大鼠分10個實驗組(n=8)：Ⅰ組(子宮動脈注射1μl生理鹽水)；Ⅱ組(子宮動脈注射1μl黃芪總苷,20μg)；Ⅲ組(子宮動脈注射1μl人參皂昔Rg-120μg)；Ⅳ組(子宮動脈注射1μl蛋白磷酸酯酶-2A 20μg)；V組(子宮動脈注射1μl氯化鋰20μg)； Ⅵ組(子宮動脈注射1μl生理鹽水+中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)；Ⅶ組(子宮動脈注射1μl黃芪總苷純品,20μg+中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)；Ⅷ組(子宮動脈注射1 μl人參皂苷Rg-120μg+中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)；Ⅸ組(子宮動脈微量1μl氯化鋰20μg+中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)； X組(子宮動脈注射1μl蛋白磷酸酯酶-2A 20μg+中度阻斷孕鼠的子宮動脈持續(xù)10min)。宮內窘迫處置結束后母鼠繼續(xù)妊娠至足月,剖宮娩出新生鼠,待新生鼠生長至12W時麻醉下斷頭取海馬組織。通過HPLC法檢測海馬組織內Glu的含量,通過蛋白質免疫印跡法(Western-blotting)檢測Tau蛋白-5和p-AT8Ser202在海馬組織中的表達。結果：宮內窘迫可明顯增加海馬中Glu濃度、黃芪總苷和人參皂苷Rg-1在有、無宮內窘迫均可減少Glu濃度；蛋白磷酸酯酶-2A、氯化鋰對胎兒宮內窘迫后海馬內Glu濃度沒有明顯影響。結論：雙黃芪總苷和人參皂苷Rg-1可以用于預防和治療宮內窘迫后學習記憶等腦功能障礙；氯化鋰和蛋白磷酸酯酶-2A因對海馬組織的Glu濃度沒有明顯影響,不建議用于治療。其原因推測為四種藥物作用機制不同造成的,具體機制需要進一步研究。全文結論1 宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激誘發(fā)海馬谷氨酸濃度升高,子宮動脈的阻斷程度和阻斷時間均可明顯影響這一過程,兩者作用疊加。2宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激誘發(fā)海馬組織內的谷氨酸濃度明顯升高,谷氨酸激動谷氨酸受體,從而通過上調糖原合成酶激酶-3β增加海馬Tau蛋白的磷酸化程度,從而誘發(fā)學習記憶障礙。3 谷氨酸受體拮抗劑(例如N-甲基-D-天冬氨酸受體受體拮抗劑MK801)、黃芪總苷通過降低海馬谷氨酸濃度下調糖原合成酶激酶-3β的表達,從而減緩Tau蛋白的磷酸化程度以改善宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激后的學習記憶能力。4黃芪總苷改善大鼠宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激后學習記憶能力的效果優(yōu)于N-甲基-D-天冬氨酸受體受體拮抗劑。5人參皂昔亦能降低改善宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激后海馬組織內過度升高的谷氨酸濃度,從而緩解宮內窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激導致的神經元興奮性毒性,其作用效果與黃芪總苷相類似。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.94

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 林也容;林進皇;吳芳芳;郁毅剛;;急性胎兔宮內窘迫模型腦組織病理及NMDAr1表達實驗研究[J];中國醫(yī)藥科學;2013年23期

本文編號：2730070