【摘要】： 成癮性物質(zhì)是一類能夠影響人類情緒、行為,改變意識(shí)狀態(tài),并有致依賴作用的化學(xué)物質(zhì)。成癮性物質(zhì)濫用既是全球普遍存在的公共衛(wèi)生問(wèn)題,又是危害嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。復(fù)吸是藥物依賴狀態(tài)的一個(gè)重要特征。目前認(rèn)為,導(dǎo)致復(fù)吸的主要因素有兩個(gè):一是長(zhǎng)期存在的精神依賴,導(dǎo)致強(qiáng)迫性覓藥和用藥行為反復(fù)出現(xiàn);二是藥物戒斷后長(zhǎng)期的睡眠障礙、節(jié)律紊亂、軀體癥狀、負(fù)性情緒等稽延性戒斷癥狀。 條件位置偏愛(ài)(conditioned place preference, CPP)可應(yīng)用于可卡因等成癮性物質(zhì)的精神依賴潛力評(píng)價(jià)。一些行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn),藥物依賴相關(guān)行為,包括自發(fā)活動(dòng)、敏化,條件位置偏愛(ài)及自我給藥等,都存在晝夜差異,且可能與中腦邊緣系統(tǒng)多巴胺能遞質(zhì)系統(tǒng)的晝夜調(diào)節(jié)有關(guān)。然而,有關(guān)可卡因條件位置偏愛(ài)晝夜差異的腦內(nèi)分子機(jī)制還有待于探索。 有研究顯示,可卡因依賴者戒斷后,雖然不會(huì)出現(xiàn)像阿片類物質(zhì)濫用戒斷時(shí)明顯的軀體癥狀和自主神經(jīng)系統(tǒng)紊亂綜合癥,但是通常會(huì)伴有明顯的精神癥狀,如失眠、焦慮、抑郁等,正是這些嚴(yán)重的稽延性癥狀最終導(dǎo)致可卡因依賴者復(fù)吸。但是,可卡因慢性稽延性癥狀產(chǎn)生的腦內(nèi)分子機(jī)制還有待于研究。 最近有研究發(fā)現(xiàn),腦內(nèi)晝夜節(jié)律基因的活動(dòng)與藥物成癮關(guān)系密切,而且這些晝夜節(jié)律分子的活性和穩(wěn)定性受某些激酶,如糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的影響。糖原合酶激酶3β(GSK-3β)普遍存在于機(jī)體的各種組織,在神經(jīng)系統(tǒng)中有高表達(dá),其本質(zhì)為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究表明GSK-3β參與了體內(nèi)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),功能上涉及蛋白合成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、微管形成及神經(jīng)元凋亡等活動(dòng)。尤其是近年來(lái)發(fā)現(xiàn),非典型的多巴胺D2受體-蛋白激酶B-糖原合成酶激酶3β信號(hào)途徑(D2-AKT- GSK-3βsignal pathway)與多巴胺樣行為的表達(dá)及多種精神疾病相關(guān)。 為此,本研究擬給予大鼠可卡因慢性處理,在觀察其條件位置偏愛(ài)形成的晝夜差異及戒斷后稽延性癥狀的基礎(chǔ)上,探討這些行為變化與腦內(nèi)GSK-3β的關(guān)系,以期深化理解可卡因精神依賴性以及復(fù)吸的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制,為其防治提供新的作用途徑和新的藥物作用靶點(diǎn)。主要內(nèi)容包括以下兩部分: 1.可卡因條件位置偏愛(ài)的晝夜差異及其與腦內(nèi)GSK-3β的關(guān)系本部分研究包括以下四方面內(nèi)容: (1)naive大鼠腦內(nèi)GSK-3β活性的晝夜節(jié)律性分析 正常SD大鼠在12h/12h晝夜環(huán)境(早上5:00開(kāi)燈,為ZT0;下午17:00關(guān)燈,為ZT12)適應(yīng)7天后。第8天開(kāi)始,分別在5:00(ZT0),9:00(ZT4),13:00(ZT8),17:00(ZT12),21:00(ZT16),1:00(ZT20)和5:00(ZT24)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集大鼠的4個(gè)腦區(qū)(下丘腦視交叉上核,SCN;前額葉皮層,PFC;中腦腹側(cè)被蓋區(qū),VTA和伏隔核,NAc)組織。采用western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)磷酸化GSK3β/pGSK-3β(GSK-3β磷酸化反應(yīng)GSK-3β活性下降)的相對(duì)水平,并用生物節(jié)律余弦分析法和方差分析統(tǒng)計(jì)方法,分析GSK-3β活性的晝夜節(jié)律性。結(jié)果表明,在正常大鼠腦內(nèi),SCN、PFC、VTA及NAc中pGSK-3β水平存在著顯著的晝夜節(jié)律性。 (2)可卡因CPP形成的晝夜差異性觀察 在同樣的飼養(yǎng)環(huán)境下,分別在ZT4和ZT16時(shí)間點(diǎn),給予大鼠腹腔注射10mg/kg的可卡因,對(duì)其進(jìn)行為期8天的可卡因CPP訓(xùn)練。第9天在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)測(cè)試大鼠可卡因CPP的表達(dá)強(qiáng)度(即ZT4點(diǎn)訓(xùn)練,ZT4點(diǎn)測(cè)試;ZT16點(diǎn)訓(xùn)練,ZT16點(diǎn)測(cè)試),以觀察可卡因CPP形成的晝夜差異。結(jié)果顯示,腹腔注射10 mg/kg的可卡因,可訓(xùn)練大鼠形成可卡因CPP,且有顯著的晝夜差異,表現(xiàn)為白天表達(dá)顯著強(qiáng)于晚上。 (3)可卡因CPP測(cè)試后大鼠腦區(qū)pGSK-3β的檢測(cè) 大鼠可卡因CPP測(cè)試結(jié)束后,立即在各自時(shí)間點(diǎn)(ZT4和ZT16)采集四個(gè)腦區(qū)(同上)組織,采用western blot檢測(cè)pGSK-3β水平,并用方差分析比較其差異。結(jié)果表明,在SCN區(qū),白天給予可卡因可以顯著降低其內(nèi)pGSK-3β水平,但晚上給予可卡因無(wú)顯著影響;生理鹽水組大鼠pGSK-3β水平,白天高于晚上,而可卡因組pGSK-3β水平無(wú)顯著晝夜差異。在PFC區(qū),白天或晚上給予可卡因,pGSK-3β水平均無(wú)顯著變化;生理鹽水組大鼠的pGSK-3β水平白天高于晚上,且可卡因組水平依然為白天高于晚上。在VTA區(qū),白天或晚上給予可卡因,pGSK-3β水平均較生理鹽水組有顯著下降;生理鹽水組大鼠的pGSK-3β水平白天高于晚上,且可卡因組水平依然為白天高于晚上。在NAc區(qū),pGSK-3β變化規(guī)律類似于SCN區(qū)。 (4)核團(tuán)微注射SB216763對(duì)大鼠可卡因CPP形成的影響 分析上述3部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)大鼠VTA腦區(qū)pGSK-3β水平的變化規(guī)律與可卡因CPP的晝夜變化最為匹配,故而采取核團(tuán)微注射方法,在VTA給予GSK-3β活性抑制劑SB216763(1ng/side),觀察其對(duì)大鼠可卡因CPP形成的影響。結(jié)果表明,大鼠VTA核團(tuán)微注射SB216763后,可卡因CPP在白天和晚上均可形成,但晝夜差異消失。 以上結(jié)果提示,中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)GSK-3β活性的晝夜變化參與了可卡因CPP晝夜差異的形成。 2.可卡因慢性稽延性癥狀變化及其與腦內(nèi)GSK-3β的關(guān)系本部分研究包括以下三個(gè)階段: (1)實(shí)驗(yàn)分組及可卡因慢性給藥 本部分實(shí)驗(yàn)大鼠在12h/12h晝夜環(huán)境(早上8:00開(kāi)燈,為ZT0;下午20:00關(guān)燈,為ZT12)適應(yīng)7天后,分為可卡因和生理鹽水兩個(gè)大組。對(duì)可卡因組大鼠,給予20mg/kg劑量的可卡因連續(xù)腹腔注射14天,然后戒斷3天、10天和30天,分別命名為d3、d10和d30組;對(duì)生理鹽水組大鼠,給予同等體積的生理鹽水連續(xù)腹腔注射14天,命名為saline組。上述四個(gè)小組(saline組和d3、d10及d30組)的大鼠再分別設(shè)置7個(gè)時(shí)間點(diǎn),即:8:00(ZT0),12:00(ZT4),16:00(ZT8),20:00(ZT12),0:00(ZT16),4:00(ZT20)和8:00(ZT24)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠,共168只。 (2)可卡因稽延性癥狀觀察 大鼠連續(xù)14天腹腔注射可卡因后,戒斷3天、10天和30天,分別測(cè)定各組大鼠的體重增重;并采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高價(jià)十字迷宮和糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn),觀察大鼠的自發(fā)活動(dòng)、緊張、焦慮及抑郁樣癥狀等稽延性癥狀。結(jié)果顯示,大鼠的體重增重,d3組顯著低于saline組,而d10,d30組與saline組比較無(wú)顯著變化。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的大鼠爬格數(shù)(反映大鼠水平運(yùn)動(dòng)活性),d3、d10及d30組與saline組比較均顯著下降;直立次數(shù)(反映大鼠垂直運(yùn)動(dòng)活性及探究行為),d3,d10及d30組與saline組大鼠比較無(wú)顯著差異;糞粒數(shù)(反映大鼠緊張狀態(tài)),d3組顯著多于saline組, d10及d30組與saline組無(wú)顯著差異。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定的大鼠進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)及時(shí)間比例,d3及d30組與saline組比較無(wú)顯著差異,d10組顯著高于saline組;進(jìn)入閉臂次數(shù)及時(shí)間比列,d3及d30組與saline組比較無(wú)顯著差異,d10組顯著低于saline組。大鼠糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)顯示,d3組大鼠糖水消費(fèi)比例顯著低于saline組,而d10和d30組與saline組比較無(wú)顯著性差異。 (3)可卡因慢性處理大鼠戒斷后腦內(nèi)pGSK-3β變化的檢測(cè) 上述行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后,立即采集各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠的四個(gè)核團(tuán)(SCN,PFC,VTA及NAc),采用western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)pGSK-3β的水平,用方差分析和生物節(jié)律余弦分析法,分析各腦區(qū)pGSK-3β含量及節(jié)律的變化。結(jié)果表明,在SCN區(qū),saline組大鼠pGSK-3β水平呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性,可卡因慢性處理后戒斷3天,節(jié)律性依然存在;而戒斷10天和30天,節(jié)律性消失;與saline組比較,d3、d10及d30組的大鼠pGSK-3β含量均顯著降低。在PFC區(qū),saline組大鼠pGSK-3β水平呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性,可卡因慢性處理后戒斷3天、10天和30天,節(jié)律性消失;與saline組比較,d3、d10組大鼠pGSK-3β的含量顯著降低;而d30組的顯著增加。在VTA區(qū),saline組大鼠pGSK-3β水平呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性,可卡因慢性處理后戒斷3天、10天和30天,節(jié)律性消失;與saline組比較,d3、d10及d30組的大鼠pGSK-3β含量均顯著增加。在NAC區(qū),saline組大鼠pGSK-3β水平呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性,可卡因慢性處理后戒斷3天,節(jié)律依然存在;戒斷10天和30天,節(jié)律性消失;與saline組比較,d3、d10及d30組的大鼠pGSK-3β含量均顯著增加。 綜合分析以上結(jié)果提示,慢性可卡因處理后戒斷3天時(shí),大鼠稽延性癥狀主要表現(xiàn)為體重增重減少、自發(fā)活動(dòng)減少、緊張及輕度抑郁;戒斷10天時(shí),主要表現(xiàn)為焦慮;而戒斷30天,主要表現(xiàn)自發(fā)活動(dòng)減少。同時(shí),腦內(nèi)pGSK-3β水平的晝夜節(jié)律性,除了SCN和NAc的在戒斷3天依然存在外,其余的均消失;而各腦區(qū)pGSK-3β的含量,在不同戒斷時(shí)間均有變化(增加或減少)。由此我們推測(cè),可卡因慢性處理大鼠,戒斷不同時(shí)間后出現(xiàn)的稽延性癥狀可能與腦內(nèi)GSK3β水平及節(jié)律性的變化有關(guān),但兩者間的確切關(guān)系及其機(jī)制需待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。 綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn): 1.正常大鼠腦內(nèi)(SCN,PFC,VTA及NAc)GSK-3β活性呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性;且中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)GSK-3β活性的晝夜變化參與了可卡因CPP晝夜差異的形成。 2.可卡因慢性處理后戒斷3天、10天和30天,大鼠的稽延性癥狀各不相同;同時(shí)大鼠腦內(nèi)(SCN,PFC,VTA及NAc)GSK-3β活性及晝夜節(jié)律性出現(xiàn)異常,提示兩者之間有一定相關(guān)性。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R749.61
【圖文】：

圖 1-A：晝夜節(jié)律參數(shù)。包括：振幅（Amplitude），是指節(jié)律曲線中峰值與谷值之差；時(shí)相（指周期中，某一參考點(diǎn)（如峰值）與某一固定事件（如暗時(shí)相的起點(diǎn)）之間的時(shí)限；周期（是指兩個(gè)相位參考點(diǎn)（如兩個(gè)峰值之間）之間的時(shí)間間隔。

圖 1-A：晝夜節(jié)律參數(shù)。包括：振幅（Amplitude），是指節(jié)律曲線中峰值與谷值之差；時(shí)相（指周期中，某一參考點(diǎn)（如峰值）與某一固定事件（如暗時(shí)相的起點(diǎn)）之間的時(shí)限；周期（是指兩個(gè)相位參考點(diǎn)（如兩個(gè)峰值之間）之間的時(shí)間間隔。

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2729225