【摘要】： 成癮性物質是一類能夠影響人類情緒、行為,改變意識狀態(tài),并有致依賴作用的化學物質。成癮性物質濫用既是全球普遍存在的公共衛(wèi)生問題,又是危害嚴重的社會問題。復吸是藥物依賴狀態(tài)的一個重要特征。目前認為,導致復吸的主要因素有兩個:一是長期存在的精神依賴,導致強迫性覓藥和用藥行為反復出現(xiàn);二是藥物戒斷后長期的睡眠障礙、節(jié)律紊亂、軀體癥狀、負性情緒等稽延性戒斷癥狀。 條件位置偏愛(conditioned place preference, CPP)可應用于可卡因等成癮性物質的精神依賴潛力評價。一些行為學研究發(fā)現(xiàn),藥物依賴相關行為,包括自發(fā)活動、敏化,條件位置偏愛及自我給藥等,都存在晝夜差異,且可能與中腦邊緣系統(tǒng)多巴胺能遞質系統(tǒng)的晝夜調節(jié)有關。然而,有關可卡因條件位置偏愛晝夜差異的腦內分子機制還有待于探索。 有研究顯示,可卡因依賴者戒斷后,雖然不會出現(xiàn)像阿片類物質濫用戒斷時明顯的軀體癥狀和自主神經(jīng)系統(tǒng)紊亂綜合癥,但是通常會伴有明顯的精神癥狀,如失眠、焦慮、抑郁等,正是這些嚴重的稽延性癥狀最終導致可卡因依賴者復吸。但是,可卡因慢性稽延性癥狀產(chǎn)生的腦內分子機制還有待于研究。 最近有研究發(fā)現(xiàn),腦內晝夜節(jié)律基因的活動與藥物成癮關系密切,而且這些晝夜節(jié)律分子的活性和穩(wěn)定性受某些激酶,如糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的影響。糖原合酶激酶3β(GSK-3β)普遍存在于機體的各種組織,在神經(jīng)系統(tǒng)中有高表達,其本質為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究表明GSK-3β參與了體內一系列的信號轉導,功能上涉及蛋白合成、細胞增殖、細胞分化、微管形成及神經(jīng)元凋亡等活動。尤其是近年來發(fā)現(xiàn),非典型的多巴胺D2受體-蛋白激酶B-糖原合成酶激酶3β信號途徑(D2-AKT- GSK-3βsignal pathway)與多巴胺樣行為的表達及多種精神疾病相關。 為此,本研究擬給予大鼠可卡因慢性處理,在觀察其條件位置偏愛形成的晝夜差異及戒斷后稽延性癥狀的基礎上,探討這些行為變化與腦內GSK-3β的關系,以期深化理解可卡因精神依賴性以及復吸的神經(jīng)生物學機制,為其防治提供新的作用途徑和新的藥物作用靶點。主要內容包括以下兩部分: 1.可卡因條件位置偏愛的晝夜差異及其與腦內GSK-3β的關系本部分研究包括以下四方面內容: (1)naive大鼠腦內GSK-3β活性的晝夜節(jié)律性分析 正常SD大鼠在12h/12h晝夜環(huán)境(早上5:00開燈,為ZT0;下午17:00關燈,為ZT12)適應7天后。第8天開始,分別在5:00(ZT0),9:00(ZT4),13:00(ZT8),17:00(ZT12),21:00(ZT16),1:00(ZT20)和5:00(ZT24)7個時間點采集大鼠的4個腦區(qū)(下丘腦視交叉上核,SCN;前額葉皮層,PFC;中腦腹側被蓋區(qū),VTA和伏隔核,NAc)組織。采用western blot檢測不同時間點磷酸化GSK3β/pGSK-3β(GSK-3β磷酸化反應GSK-3β活性下降)的相對水平,并用生物節(jié)律余弦分析法和方差分析統(tǒng)計方法,分析GSK-3β活性的晝夜節(jié)律性。結果表明,在正常大鼠腦內,SCN、PFC、VTA及NAc中pGSK-3β水平存在著顯著的晝夜節(jié)律性。 (2)可卡因CPP形成的晝夜差異性觀察 在同樣的飼養(yǎng)環(huán)境下,分別在ZT4和ZT16時間點,給予大鼠腹腔注射10mg/kg的可卡因,對其進行為期8天的可卡因CPP訓練。第9天在相應的時間點測試大鼠可卡因CPP的表達強度(即ZT4點訓練,ZT4點測試;ZT16點訓練,ZT16點測試),以觀察可卡因CPP形成的晝夜差異。結果顯示,腹腔注射10 mg/kg的可卡因,可訓練大鼠形成可卡因CPP,且有顯著的晝夜差異,表現(xiàn)為白天表達顯著強于晚上。 (3)可卡因CPP測試后大鼠腦區(qū)pGSK-3β的檢測 大鼠可卡因CPP測試結束后,立即在各自時間點(ZT4和ZT16)采集四個腦區(qū)(同上)組織,采用western blot檢測pGSK-3β水平,并用方差分析比較其差異。結果表明,在SCN區(qū),白天給予可卡因可以顯著降低其內pGSK-3β水平,但晚上給予可卡因無顯著影響;生理鹽水組大鼠pGSK-3β水平,白天高于晚上,而可卡因組pGSK-3β水平無顯著晝夜差異。在PFC區(qū),白天或晚上給予可卡因,pGSK-3β水平均無顯著變化;生理鹽水組大鼠的pGSK-3β水平白天高于晚上,且可卡因組水平依然為白天高于晚上。在VTA區(qū),白天或晚上給予可卡因,pGSK-3β水平均較生理鹽水組有顯著下降;生理鹽水組大鼠的pGSK-3β水平白天高于晚上,且可卡因組水平依然為白天高于晚上。在NAc區(qū),pGSK-3β變化規(guī)律類似于SCN區(qū)。 (4)核團微注射SB216763對大鼠可卡因CPP形成的影響 分析上述3部分實驗結果,發(fā)現(xiàn)大鼠VTA腦區(qū)pGSK-3β水平的變化規(guī)律與可卡因CPP的晝夜變化最為匹配,故而采取核團微注射方法,在VTA給予GSK-3β活性抑制劑SB216763(1ng/side),觀察其對大鼠可卡因CPP形成的影響。結果表明,大鼠VTA核團微注射SB216763后,可卡因CPP在白天和晚上均可形成,但晝夜差異消失。 以上結果提示,中腦腹側被蓋區(qū)(VTA)GSK-3β活性的晝夜變化參與了可卡因CPP晝夜差異的形成。 2.可卡因慢性稽延性癥狀變化及其與腦內GSK-3β的關系本部分研究包括以下三個階段: (1)實驗分組及可卡因慢性給藥 本部分實驗大鼠在12h/12h晝夜環(huán)境(早上8:00開燈,為ZT0;下午20:00關燈,為ZT12)適應7天后,分為可卡因和生理鹽水兩個大組。對可卡因組大鼠,給予20mg/kg劑量的可卡因連續(xù)腹腔注射14天,然后戒斷3天、10天和30天,分別命名為d3、d10和d30組;對生理鹽水組大鼠,給予同等體積的生理鹽水連續(xù)腹腔注射14天,命名為saline組。上述四個小組(saline組和d3、d10及d30組)的大鼠再分別設置7個時間點,即:8:00(ZT0),12:00(ZT4),16:00(ZT8),20:00(ZT12),0:00(ZT16),4:00(ZT20)和8:00(ZT24)。每個時間點6只大鼠,共168只。 (2)可卡因稽延性癥狀觀察 大鼠連續(xù)14天腹腔注射可卡因后,戒斷3天、10天和30天,分別測定各組大鼠的體重增重;并采用曠場實驗、高價十字迷宮和糖水偏愛實驗,觀察大鼠的自發(fā)活動、緊張、焦慮及抑郁樣癥狀等稽延性癥狀。結果顯示,大鼠的體重增重,d3組顯著低于saline組,而d10,d30組與saline組比較無顯著變化。曠場實驗測定的大鼠爬格數(shù)(反映大鼠水平運動活性),d3、d10及d30組與saline組比較均顯著下降;直立次數(shù)(反映大鼠垂直運動活性及探究行為),d3,d10及d30組與saline組大鼠比較無顯著差異;糞粒數(shù)(反映大鼠緊張狀態(tài)),d3組顯著多于saline組, d10及d30組與saline組無顯著差異。高架十字迷宮實驗測定的大鼠進入開臂次數(shù)及時間比例,d3及d30組與saline組比較無顯著差異,d10組顯著高于saline組;進入閉臂次數(shù)及時間比列,d3及d30組與saline組比較無顯著差異,d10組顯著低于saline組。大鼠糖水偏愛實驗顯示,d3組大鼠糖水消費比例顯著低于saline組,而d10和d30組與saline組比較無顯著性差異。 (3)可卡因慢性處理大鼠戒斷后腦內pGSK-3β變化的檢測 上述行為學檢測結束后,立即采集各時間點各組大鼠的四個核團(SCN,PFC,VTA及NAc),采用western blot檢測不同時間點pGSK-3β的水平,用方差分析和生物節(jié)律余弦分析法,分析各腦區(qū)pGSK-3β含量及節(jié)律的變化。結果表明,在SCN區(qū),saline組大鼠pGSK-3β水平呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性,可卡因慢性處理后戒斷3天,節(jié)律性依然存在;而戒斷10天和30天,節(jié)律性消失;與saline組比較,d3、d10及d30組的大鼠pGSK-3β含量均顯著降低。在PFC區(qū),saline組大鼠pGSK-3β水平呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性,可卡因慢性處理后戒斷3天、10天和30天,節(jié)律性消失;與saline組比較,d3、d10組大鼠pGSK-3β的含量顯著降低;而d30組的顯著增加。在VTA區(qū),saline組大鼠pGSK-3β水平呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性,可卡因慢性處理后戒斷3天、10天和30天,節(jié)律性消失;與saline組比較,d3、d10及d30組的大鼠pGSK-3β含量均顯著增加。在NAC區(qū),saline組大鼠pGSK-3β水平呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性,可卡因慢性處理后戒斷3天,節(jié)律依然存在;戒斷10天和30天,節(jié)律性消失;與saline組比較,d3、d10及d30組的大鼠pGSK-3β含量均顯著增加。 綜合分析以上結果提示,慢性可卡因處理后戒斷3天時,大鼠稽延性癥狀主要表現(xiàn)為體重增重減少、自發(fā)活動減少、緊張及輕度抑郁;戒斷10天時,主要表現(xiàn)為焦慮;而戒斷30天,主要表現(xiàn)自發(fā)活動減少。同時,腦內pGSK-3β水平的晝夜節(jié)律性,除了SCN和NAc的在戒斷3天依然存在外,其余的均消失;而各腦區(qū)pGSK-3β的含量,在不同戒斷時間均有變化(增加或減少)。由此我們推測,可卡因慢性處理大鼠,戒斷不同時間后出現(xiàn)的稽延性癥狀可能與腦內GSK3β水平及節(jié)律性的變化有關,但兩者間的確切關系及其機制需待進一步實驗證實。 綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn): 1.正常大鼠腦內(SCN,PFC,VTA及NAc)GSK-3β活性呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性;且中腦腹側被蓋區(qū)(VTA)GSK-3β活性的晝夜變化參與了可卡因CPP晝夜差異的形成。 2.可卡因慢性處理后戒斷3天、10天和30天,大鼠的稽延性癥狀各不相同;同時大鼠腦內(SCN,PFC,VTA及NAc)GSK-3β活性及晝夜節(jié)律性出現(xiàn)異常,提示兩者之間有一定相關性。
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R749.61
【圖文】：

圖 1-A：晝夜節(jié)律參數(shù)。包括：振幅（Amplitude），是指節(jié)律曲線中峰值與谷值之差；時相（指周期中，某一參考點（如峰值）與某一固定事件（如暗時相的起點）之間的時限；周期（是指兩個相位參考點（如兩個峰值之間）之間的時間間隔。

圖 1-A：晝夜節(jié)律參數(shù)。包括：振幅（Amplitude），是指節(jié)律曲線中峰值與谷值之差；時相（指周期中，某一參考點（如峰值）與某一固定事件（如暗時相的起點）之間的時限；周期（是指兩個相位參考點（如兩個峰值之間）之間的時間間隔。

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本文編號：2729225