發(fā)布時間：2020-06-25 13:14

【摘要】：2-(α-羥基戊基)苯基酸鉀鹽(Potassium2-(1-hydroxypentyl)-benzoate, dl-PHPB)是中國醫(yī)學科學院藥物研究所研發(fā)的的新化合物,它是丁基苯酞的前藥。以往的研究表明,dl-PHPB可改善缺血區(qū)腦血流,降低梗死體積。此外,dl-PHPB對慢性腦低灌注大鼠、Aβ誘導的癡呆及快速老化小鼠的學習和記憶障礙均有改善作用,為了進一步明確dl-PHPB的抗AD作用靶點,本研究觀察了dl-PHPB的神經(jīng)保護作用,并對dl-PHPB的抗AD作用機制進行了探討。本工作分為以下幾個方面： 第一部分2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對過氧化氫損傷的SK-N-SH細胞抗凋亡作用研究 凋亡是由基因調(diào)控的細胞自主性、程序性死亡。目前許多研究表明在神經(jīng)退行性疾病和腦卒中病人的腦組織中存在大量神經(jīng)元的凋亡,而氧化應激是引起神經(jīng)元凋亡的L要原因。因此,能夠抑制氧化應激所致凋亡的藥物可能在治療神經(jīng)退行性疾病和腦卒中中有著很好的應用前景。為此,我們采用H2O2損傷模型,觀察dl-PHPB的神經(jīng)保護作用及其可能的機制。 我們首先評價了dl-PHPB對H2O2損傷的SK-N-SH細胞生存率和凋亡率的影響。利用MTT方法檢測細胞生存率,結果顯示,SK-N-SH細胞經(jīng)H2O2150μM作用24h后,生存率顯著低于正常對照組,dl-PHPB10μM處理組可顯著提高細胞生存率。應用Hoechst33342熒光染色法檢測細胞凋亡。結果顯示,正常對照組細胞的凋亡率較低,經(jīng)H2O2處理24h后細胞凋亡率明顯升高,給予0.1、1、及10μM dl-PHPB處理后,細胞凋亡率呈劑量依賴性下降,其中dl-PHPB1、10μM劑量組的細胞凋亡率與模型組相比具有顯著性差異。 為進一步了解dl-PHPB的抗凋亡作用機理,我們對凋亡相關基因的表達進行了測定。Real-Time PCR結果顯示H2O2損傷24h后SK-N-SH細胞中Bax基因表達明顯增加,Bcl-w表達顯著下降,給予dl-PHPB10μM處理的細胞其Bax基因表達明顯下降,Bcl-w表達明顯增加。Western blot結果顯示H2O2可明顯下調(diào)Bcl-2的表達,對Bax、Caspase3的蛋白表達具有上調(diào)作用,dl-PHPB處理后可部分逆轉(zhuǎn)以上作用,顯示dl-PHPB抗凋亡作用與其調(diào)節(jié)凋亡相關基因的表達有關。 隨后,我們對凋亡相關基因的上游信號通路PKCa的蛋白表達進行了測定。結果顯示H2O2損傷24h后,PKCa的表達明顯下降,給予dl-PHPB處理后,可顯著上調(diào)PKCa的表達。 本部分研究提示dl-PHPB可能通過增加PKCa的表達而增加抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-w的表達,降低促凋亡基因Bax、Caspase3的表達而發(fā)揮其抗凋亡作用,PKC信號通路可能參與dl-PHPB的神經(jīng)保護作用。 第二部分2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠抗AD作用機制研究 細胞外由β-淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑和細胞內(nèi)以過磷酸化的Tau蛋白為核心形成的神經(jīng)元纖維纏結是阿爾茨海默病的的兩大病理學特征,本研究采用APP/PS1轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠模型,重點觀察了dl-PHPB對15月齡轉(zhuǎn)基因小鼠皮層、海馬中Tau蛋白、β-淀粉樣蛋白及其相關凋節(jié)酶的影響。 Western blot結果顯示,與同齡野生型小鼠相比,15月齡轉(zhuǎn)基因小鼠皮層、海馬中P-Tau (S396)、P-Tau (T205)位點的蛋白表達明顯增高,給予dl-PHPB30mg/kg處理后可顯著降低轉(zhuǎn)基因小鼠皮層、海馬中P-Tau (S396)、P-Tau (T205)位點的蛋白表達。在皮層中,P-Tau (S199)位點的蛋白表達在野生型與轉(zhuǎn)基因小鼠中沒有明顯差別。轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中的P-Tau (S199)蛋白表達顯著高于同齡野生型小鼠,給予dl-PHPB處理后可顯著降低該蛋白的表達。轉(zhuǎn)基因小鼠P-Tau (S404)位點的蛋白表達在野生型與轉(zhuǎn)基因小鼠皮層、海馬中均沒有明顯差別,dl-PHPB對P-Tau (S404)位點的蛋白表達也無明顯調(diào)節(jié)作用。 隨后,我們對調(diào)節(jié)Tau蛋白磷酸化的主要蛋白激酶GSK-3β、CDK5及磷酸酶PP2A的蛋白表達進行了測定。結果表明,與野生型小鼠相比,轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中P-GSK-3β(Y216)位點的蛋白表達明顯增加,dl-PHPB可顯著降低其表達。Tg小鼠皮層、海馬中P-CDK5(S159)位點的蛋白表達均明顯高于同齡野生型小鼠,dl-PHPB可顯著降低Tg小鼠皮層、海馬中P-CDK5(S159)位點的蛋自表達。與野生型小鼠相比,APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠皮層、海馬中total-GSK-3β和total-CDK5的蛋白表達無明顯改變,dl-PHPB對total-GSK-3β和total-CDK5的蛋自表達也無明顯影響。P-GSK-3p(S9).P-GSK-3α(Y279)及PP2A的蛋白表達在各組間亦無顯著差別。 免疫組化結果顯示,在15月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠皮層及海馬中均有大量β-淀粉樣肽沉積,在皮層及海馬中,dl-PHPB處理組與轉(zhuǎn)基因組小鼠相比β-淀粉樣肽的含量均無明顯改變。與同月齡野生型小鼠相比,15月齡轉(zhuǎn)基因小鼠皮層、海馬中TBS soluble、TBST soluble和Guanidine soluble的Aβ1-42含量明顯增加,dl-PHPB對三種形式的Aβ1-42含量均無明顯影響。 Western blot結果顯示,與野生型小鼠相比,轉(zhuǎn)基因小鼠皮層及海馬中的P-APP(T668)位點的蛋白表達顯著增加,給予dl-PHPB處理后可明顯降低P-APP(T668)位點的蛋白表達。APP、α-APP、ADAM17及ADAM10的蛋白表達在野生型小鼠、轉(zhuǎn)基因小鼠及dl-PHPB處理組小鼠皮層和海馬中均無明顯改變。 本部分研究提示dl-PHPB對Tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)作用及對磷酸化APP的降低作用可能與其抗AD作用有關。GSK-3β和CDK5參與dl-PHPB對磷酸化Tau蛋白的調(diào)節(jié)作用。dl-PHPB對β-淀粉樣肽的含量無明顯調(diào)節(jié)作用。 第三部分：2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP695的SK-N-SH細胞中Tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)作用研究 Tau蛋白磷酸化誘導的神經(jīng)元毒性被認為是阿爾茨海默病的重要病理機制之一,在本部分研究中,我們對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP695的SK-N-SH細胞中磷酸化Tau蛋白Ser396、Thr205和Ser199位點的蛋白表達進行了測定,并評價了dl-PHPB對三種磷酸化Tau蛋白的含量影響。在此基礎上重點觀察了dl-PHPB對Tau蛋白磷酸化的主要蛋白激酶GSK-3β和CDK5的蛋白表達影響,以期闡明dl-PHPB的抗AD作用機理。 Western blot結果顯示,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP695的SK-N-SH細胞中Ser396、Thr205和Ser199位點的Tau蛋白表達顯著高于野生型SK-N-SH細胞,給予dl-PHPB處理后,可明顯降低Ser396、Thr205位點的Tau蛋白表達。dl-PHPB對Ser199位點的Tau蛋白表達無明顯影響。 對GSK-3β和CDK5的研究表明,dl-PHPB1μM可顯著增加P-GSK-3β (S9)位點的蛋白表達。dl-PHPB0.1μM、1μM和10μM處理后均能不同程度抑制P-GSK-3p (Y216)、P-GSK3a(Y279)和P-CDK5(S159)位點的蛋自表達,但對total GSK-3β和CDK5的蛋白表達沒有明顯影響。以L對SK-N-SH APP695細胞株中不同位點的Tau蛋白磷酸化水平的研究提示,dl-PHPB可能通過調(diào)節(jié)GSK-3β和CDK5的磷酸化水平而抑制Tau蛋白磷酸化,發(fā)揮其抗AD的作用。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R749.16

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本文編號：2729188