【摘要】：阿爾茨海默�。ˋD）和相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病在老年人中的發(fā)病率越來越高，甚至被認(rèn)為是二十一世紀(jì)的瘟疫。神經(jīng)營養(yǎng)因子作為神經(jīng)保護(hù)劑用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病已得到了廣泛關(guān)注，但因其均為大分子蛋白質(zhì)而難以通過血腦屏障的特點(diǎn)限制了臨床應(yīng)用。近年來小分子肽被認(rèn)為可能成為它的替代品�；钚砸蕾囆陨窠�(jīng)保護(hù)蛋白（activity-dependent neuroprotective protein，ADNP）是一種由血管內(nèi)皮腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）作用神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞后產(chǎn)生的高活性神經(jīng)營養(yǎng)因子，對多種原因引起的神經(jīng)元損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。有研究證實(shí)ADNP上的一段8肽NAP比ADNP具有更強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用以及更低的有效濃度 （10-15Mol）。雖然NAP的分子量小于1000，認(rèn)為它可以通過血腦屏障（BBB），在AD等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中擁有廣闊的前景。然而NAP的半衰期短，體外人工合成的成本較高等因素限制了其用于慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療。為了更好的將NAP用于AD的基因治療，本研究克隆了神經(jīng)保護(hù)短肽NAP cDNA，將其與神經(jīng)營養(yǎng)素4（neurotrophin 4，NT4）的信號肽和前導(dǎo)序列相連，構(gòu)建了NT4與NAP融合基因的原核表達(dá)載體pBV220/NT4-NAP，進(jìn)而成功誘導(dǎo)分泌表達(dá)了NAP蛋白。為進(jìn)一步將NAP用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的基因治療奠定了基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法 一、NAP基因cDNA的制備：采用非對稱互補(bǔ)引物/模板法，根據(jù)GenBank 提供的NAP基因序列，設(shè)計(jì)兩端含有酶切位點(diǎn)的NAP cDNA的正、負(fù)向引物/模板鏈， 正向引物/模板：5’GCAGCCGGCGTGGCAACGCACCAGTTTC-3’； WP=49 負(fù)向引物/模板：5’CGGGATCCCTCGAGTCATTGAGGAATGGAAACTGG-3’。制備兩端含有酶切位點(diǎn)的NAP的cDNA。 二、載體的構(gòu)建策略和步驟：用限制性內(nèi)切酶Nae I和BamH I聯(lián)合酶切除去質(zhì)粒pGEM-T Easy/NT4中NT4的成熟區(qū)，將NAP cDNA連接到NT4的信號肽和前導(dǎo)序列的3’端，組成融合基因NT4-NAP，篩選得到含有NT4-NAP基因的克隆。用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I聯(lián)合酶切，得到融合基因NT4-NAP，并將其亞克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pBV220中。 三、酶切鑒定和DNA測序：限制性內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒。融合基因重組于pGEM-T Easy質(zhì)粒中，篩選得到含有NT4-NAP基因的克隆。采用Sanger 單鏈末端終止法測出全部的核苷酸序列，比較該序列與GenBank所報道的結(jié)果。 四、 生物活性鑒定 經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒pBV220/NT4-NAP轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α, 42℃熱誘導(dǎo)表達(dá)融合基因，分泌表達(dá)NAP蛋白。分離培養(yǎng)8d雞胚背根神經(jīng)節(jié)(SC-DRG)，培養(yǎng)12h后加入回收的表達(dá)蛋白0.1 mL或單純培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，相差倒置顯微鏡下，觀察神經(jīng)節(jié)生長情況。用χ2檢驗(yàn)比較兩組結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)DNA測序，限制性內(nèi)切酶酶切等方法證實(shí)已成功地將NAP重組到NT4信號肽和前導(dǎo)序列的3’端。重組原核表達(dá)質(zhì)粒pBV220/ NT4-NAP構(gòu)建正確，表達(dá)框架未發(fā)生改變。成功誘導(dǎo)表達(dá)了融合基因并成功地分泌表 達(dá)NAP蛋白。表達(dá)蛋白組可見大量神經(jīng)突起自神經(jīng)節(jié)組織塊外周緣向四周呈放射狀長出，對照組未見神經(jīng)突起長出（P0.01）。 研究結(jié)果提示 成功克隆的NT4-NAP融合基因，重組于原核表達(dá)載體中，重組質(zhì)粒pBV220/NT4-NAP可分泌表達(dá)NAP蛋白，而且分泌表達(dá)的NAP WP=50 蛋白有良好的生物活性。本研究為進(jìn)一步開展NAP基因治療AD病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病創(chuàng)造了有利條件。 綜上所述，神經(jīng)營養(yǎng)因子一直被認(rèn)為在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中具有發(fā)展?jié)摿�，但因其均為大分子蛋白，無法通過血腦屏障，需腦室內(nèi)注射給藥，給臨床應(yīng)用帶來了極大困難。NAP是一種由VIP介導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的神經(jīng)保護(hù)短肽，其對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用已被大量研究證實(shí)。這些研究提示NAP在治療AD等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中有廣闊的發(fā)展前景。為了更好的應(yīng)用NAP治療AD，本研究采用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，應(yīng)用非對稱互補(bǔ)引物/模板法，根據(jù)GenBank提供基因序列克隆了NAP cDNA；由于NAP是活性依賴性神經(jīng)保護(hù)蛋白（ADNP）中一段8肽，缺少分泌表達(dá)元件，這給應(yīng)用基因工程技術(shù)在體內(nèi)或體外分泌表達(dá)NAP帶來了困難。因此本研究將NAP cDNA的5’端連接到NT4的信號肽和引導(dǎo)肽序列的3’端，構(gòu)成融合基因NT4-NAP；本研究在原核細(xì)胞系統(tǒng)經(jīng)熱誘導(dǎo)表達(dá)了融合基因，其結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白具有良好的生物學(xué)活性，能夠促進(jìn)神經(jīng)節(jié)組織周緣神經(jīng)突起的生長。這不僅是對NAP神經(jīng)營養(yǎng)作用的再次肯定；同時融合基因克隆的成功，以及在原核細(xì)胞系統(tǒng)中的正確表達(dá)和加工，為我們進(jìn)一步將NT4-NAP重組入真核細(xì)胞系統(tǒng)，在體內(nèi)外瞬時表達(dá)NAP；或?qū)⑵渲亟M入腺相關(guān)病毒（AAV），在體內(nèi)外長期表達(dá)NAP，從而構(gòu)建一種神經(jīng)保護(hù)肽的體內(nèi)分泌表達(dá)策略奠定了基礎(chǔ)。這也為其他神經(jīng)營養(yǎng)短肽的應(yīng)用提供了新的線索，為AD基因治療的下一步研究提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R749.16

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