【摘要】：目的:本研究以GSK3β為靶點,通過免疫共沉淀偶聯(lián)LTQ-Orbitrap蛋白組學技術(shù)篩選出與之相互作用的蛋白,來闡明aFGF_(14-154)及其改構(gòu)體(Tat-aFGF_(14-154))拮抗Aβ_(1-42)誘導的神經(jīng)毒性作用的分子機制,為阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的新藥開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。方法:采用Western Blotting的方法檢測不同濃度的aFGF_(14-154)、Tat-aFGF_(14-154)對N2a-APP細胞中GSK3β蛋白表達及其磷酸化的影響,采用MTT法和Western Blotting的方法摸索GSK3抑制劑BIO的給藥濃度,采用免疫熒光方法觀察aFGF_(14-154),Tat-aFGF_(14-154),GSK3抑制劑BIO對Aβ_(1-42)損傷的大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元突起的影響。用過表達APP的細胞(N2a-APP)為模型,aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)采用最佳作用濃度作用細胞后,收取蛋白用GSK3β抗體進行免疫共沉淀(Co-IP),結(jié)合LC-MS/MS(LTQ-Orbitrap)蛋白質(zhì)譜技術(shù),鑒定與GSK3β相互作用的蛋白。采用生物信息學分析GSK3β互作的蛋白質(zhì),使用Co-IP結(jié)合Western blotting的方法驗證所篩選蛋白與GSK3β之間的相互作用關(guān)系。分別用GSK3β特異抑制劑、aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)處理細胞后,以Western blotting的方法檢測所篩選蛋白的表達是否有差異。用Aβ_(1-42)處理的大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元建立AD模型,采用Western blotting檢測aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)不同處理時間對CRMP2的蛋白表達及其磷酸化水平的影響;siRNA沉默CRMP2的蛋白表達,用MTT法、Western blotting、掃描電鏡和免疫熒光技術(shù)考察CRMP2蛋白在aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)拮抗Aβ_(1-42)導致的神經(jīng)元突起損傷中的關(guān)鍵作用。結(jié)果:(1)aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)修復被Aβ_(1-42)損傷的皮質(zhì)神經(jīng)元細胞活性,促進神經(jīng)元突起的再生;GSK3抑制后aFGF的神經(jīng)保護作用顯著減弱。(2)GSK3β總蛋白表達不變的前提下,aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)促進N2a-APP細胞中GSK3β(Ser9)的蛋白磷酸化;免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定出與GSK3β相互作用的靶蛋白,通過生物信息學、文獻調(diào)研,篩選出了與神經(jīng)元突起、軸突和樹突發(fā)育與形成相關(guān)的蛋白(MAP1B、eEF2、CRMP2、CRAM5、PP2A B、TDP43);Co-IP聯(lián)合Western blotting的方法,驗證了CRMP2、CRAM5和GSK3β的相互作用;GSK3β抑制劑AR顯著下調(diào)p-GSK3?的水平和CRMP5的蛋白表達,幾乎完全抑制CRMP2的磷酸化水平。(3)在N2a-APP細胞中,aFGF_(14-154)上調(diào)GSK3β(Ser9)的蛋白磷酸化的同時,抑制CRMP2(Thr514)的蛋白磷酸化,而GSK3β和CRMP2總蛋白水平保持不變;在Aβ_(1-42)損傷的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元模型中,aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)作用24h后均可促進GSK3β(Ser9)的磷酸化,減少CRMP2(Thr514)的磷酸化,而GSK3β和CRMP2總蛋白水平仍然保持不變。(4)在Aβ_(1-42)損傷的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元模型中,利用siRNA沉默CRMP2蛋白的表達,阻斷了aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)提升細胞活力的效應,逆轉(zhuǎn)了它們對突觸相關(guān)蛋白SYN和PSD95的表達上調(diào)作用。細胞形態(tài)學上也顯示神經(jīng)元胞體和突起再度恢復到Aβ_(1-42)損傷狀態(tài),包括掃描電鏡觀察到胞體皺縮、扁平,表面突起數(shù)量減少,已有的神經(jīng)突起變短、中斷;通過免疫熒光技術(shù),以神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白2(MAP2)表征的神經(jīng)元突起長度縮短,突起間交錯形成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)基本消失。結(jié)論:在體外AD細胞模型中,aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)以CRMP2為靶點,通過促進GSK3β(Ser9)的磷酸化,抑制GSK3β的活性來減少CRMP2(Thr514)的磷酸化,促進了Aβ_(1-42)損傷的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的突起再生,從而發(fā)揮它們的神經(jīng)保護作用。
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R749.16
【圖文】：

圖 1.1 GSK3β 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)圖Fig.1.1 The structural features ofGSK3β基端的一個絲氨酸（GSK3β 的 Ser9 或[18]；相反，磷酸化 GSK3 的酪氨酸位點（可促進其活性。最初發(fā)現(xiàn) GSK3β 的生物酶活性，從而減少糖原的合成[19; 20]。隨GSK3，對其下游的各種轉(zhuǎn)錄因子、跨膜。GSK3 是一種多樣性的激酶，不同的的活性，從而影響多種生理過程。GSK3癥性疾病、癌癥、糖尿病、AD、骨質(zhì)路之間的串擾是疾病、發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)

性影響底物功能的變化，當 GSK3 氨基酸殘基靶向突變?yōu)楸钚詿o影響。GSK3 底物共識別序列是 Ser/ThrXXX，其中 X3 具有磷酸鹽結(jié)合口袋，當 GSK3ɑ/β 的 Ser21/9 磷酸化可導致酸鹽結(jié)合口袋相互作用，阻止其對底物的識別，使 GSK3 失態(tài)的 GSK3 可以磷酸化糖原合酶的 Ser652，Ser648，Ser644 和蛋白中的 Ser41，Ser37 和 Ser33 殘基[27]。GSK3 對大多數(shù)底物他的蛋白激酶先預磷酸化底物的氨基酸殘基上某個 Ser/Thr[28序列是 C 端的四個殘基 S/T-X-X-X-S/T(P)，使底物結(jié)合到由正電荷位點，誘導 GSK3 磷酸化底物 N 末端的幾個絲氨酸/蘇CREB 通過 PKB 磷酸化 Ser133，促使 GSK3 磷酸化 CREB 的REB 轉(zhuǎn)錄活性。當?shù)孜锸堑蜐舛葧r，GSK3 的 Ser9 磷酸化后著底物濃度增加時，底物可被 GSK3 再次磷酸化，說明底物的 GSK3 的活性[27]。

【參考文獻】

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本文編號：2723959