【摘要】： 目的:血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是由腦血管疾病引起的腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合癥,以記憶、認(rèn)知功能缺損為主,所以有效改善患者的學(xué)習(xí)記憶功能是血管性癡呆研究的重點(diǎn)和突破點(diǎn)所在。第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)是具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因,研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)PTEN表達(dá)對神經(jīng)元有保護(hù)作用,且作為PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵負(fù)性調(diào)節(jié)因子,PTEN在神經(jīng)元分化、樹突分枝及突觸可塑性方面也可發(fā)揮重要作用。因此,預(yù)測將其下調(diào)有可能參與改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。本課題利用PTEN特異性RNAi(RNA interference,RNA干擾)的重組腺病毒載體,轉(zhuǎn)染血管性癡呆大鼠模型,選擇與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)為切入點(diǎn),觀察PTEN基因沉默對癡呆海馬區(qū)的病理改變、CREB表達(dá)變化以及學(xué)習(xí)記憶能力的改善,闡明PTEN在血管性癡呆突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶中的重要作用,以期為臨床血管性癡呆的基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.應(yīng)用人胚腎293細(xì)胞擴(kuò)增PTEN特異性RNAi的重組腺病毒AdR-siPTEN,采用賽多利斯腺病毒純化試劑盒純化病毒并測定其滴度; 2.分別用適當(dāng)劑量的重組腺病毒和空病毒(陰性對照)轉(zhuǎn)染缺血癡呆大鼠海馬組織,熒光顯微鏡觀察紅色熒光蛋白的表達(dá),RT-PCR及Western blotting檢測腺病毒轉(zhuǎn)染后PTEN基因表達(dá)下降情況,探明RNAi對PTEN的抑制效率; 3. 40只SD大鼠隨機(jī)分為缺血癡呆組(VD組),假手術(shù)組和腺病毒處理組(siPTEN組),陰性對照組(AdRFP組)。4周后分別應(yīng)用水迷宮、HE和Nissl染色檢測各組大鼠行為學(xué)及組織病理形態(tài)學(xué)變化,觀察下調(diào)PTEN對癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響; 4.應(yīng)用RT-PCR及免疫組化分別從mRNA和蛋白水平檢測PTEN表達(dá)下調(diào)后海馬區(qū)Akt、CREB表達(dá)的變化,探討下調(diào)PTEN對血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元CREB表達(dá)的影響,從而探討PTEN基因改善缺血癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的分子機(jī)制。 結(jié)果: 1.重組腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后,熒光顯微鏡下可觀察到明確的紅色熒光,擴(kuò)增并純化后AdR-siPTEN的滴度為:3.36×1010 pfu/ml;AdRFP的滴度為:2.98×1010pfu/ml。 2.轉(zhuǎn)染腺病毒一定時(shí)限后,大鼠海馬組織均出現(xiàn)紅色熒光蛋白陽性表達(dá); RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比,缺血癡呆后,PTEN mRNA和蛋白水平明顯增高(p0.01),腺病毒干預(yù)后PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)(p0.01),而陰性對照組中PTEN表達(dá)無明顯變化(p0.05); 3.水迷宮檢測發(fā)現(xiàn)缺血癡呆后大鼠逃避潛伏期明顯延長,跨越平臺次數(shù)顯著減少,經(jīng)siPTEN處理后延長的逃避潛伏期縮短,減少的跨越平臺次數(shù)增多(P 0.01 );與AdRFP組比較,siPTEN組逃避潛伏期也明顯縮短,跨平臺次數(shù)顯著增多(P 0.01 );Nissl染色顯示,siPTEN組海馬神經(jīng)元損傷程度明顯輕于VD和AdRFP組大鼠;HE染色后光鏡下觀察,siPTEN組海馬變性程度較VD和AdRFP組明顯減輕,其結(jié)果與Nissl染色結(jié)果相吻合; 4. RT-PCR及免疫組化分別檢測CREB mRNA基因表達(dá)和蛋白水平結(jié)果均顯示:siPTEN組海馬部位CREB水平較AdRFP組明顯升高,但未至正常水平(p㩳0.01),表明siPTEN組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙得到改善可能與海馬區(qū)CREB表達(dá)升高有關(guān)。 結(jié)論: 1.采用293細(xì)胞成功擴(kuò)增了大量重組腺病毒AdR-siPTEN以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。 2.腺病毒能高效感染海馬組織,有效進(jìn)行PTEN特異性siRNA基因轉(zhuǎn)導(dǎo);腺病毒介導(dǎo)RNAi可有效、穩(wěn)定地抑制海馬組織中PTEN的表達(dá)。 3.缺血性癡呆后,大鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶障礙,腺病毒介導(dǎo)RNAi沉默PTEN基因可明顯減輕缺血癡呆海馬神經(jīng)元損傷及海馬變性,提高CREB表達(dá)水平,從而明顯改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R749.13
【圖文】：

圖 1 光學(xué)顯微鏡下 293 細(xì)胞形態(tài)（×100）Fig1 293 cells were visualized by bright microscopry（×100）圖 2 光學(xué)顯微鏡下 293 細(xì)胞形態(tài)（×200）Fig2 293 cells were visualized by bright microscopry（×200）圖 3 腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞24h后,熒光顯微鏡下觀察RFP的表達(dá)（×100）Fig3 Adenovirus was transfected into 293 cells and RFPexpression was visualized by fluorescence aftertransfection 24h （×100）圖4 腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞72h后，熒光顯微鏡下觀察RF的表達(dá)（×100）Fig4 Adenovirus was transfected into 293 cells and RFPexpression was visualized by fluorescence aftertransfection 72h（×100）

圖 1 光學(xué)顯微鏡下 293 細(xì)胞形態(tài)（×100）Fig1 293 cells were visualized by bright microscopry（×100）圖 2 光學(xué)顯微鏡下 293 細(xì)胞形態(tài)（×200）Fig2 293 cells were visualized by bright microscopry（×200）圖 3 腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞24h后,熒光顯微鏡下觀察RFP的表達(dá)（×100）Fig3 Adenovirus was transfected into 293 cells and RFPexpression was visualized by fluorescence aftertransfection 24h （×100）圖4 腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞72h后，熒光顯微鏡下觀察RF的表達(dá)（×100）Fig4 Adenovirus was transfected into 293 cells and RFPexpression was visualized by fluorescence aftertransfection 72h（×100）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李文聯(lián),王玲,張紅愛;Ca~(2+)對新生大鼠腦缺氧缺血后CREB磷酸化及神經(jīng)元凋亡的影響[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年03期

2 江剛,舒斯云,包新民;中樞學(xué)習(xí)記憶功能與環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白的關(guān)系[J];中國臨床康復(fù);2004年01期

本文編號：2715103