【摘要】： 抗凋亡蛋白Bcl-2在崗田酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞退化中的作用研究 凋亡機(jī)制參與了AD中神經(jīng)細(xì)胞退化過程。Bcl-2家族在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要調(diào)節(jié)作用。Bcl-2家族包括促凋亡和抑凋亡兩類作用相反的蛋白，Bcl-2是起抑凋亡作用的代表性成員，其抗凋亡作用與家族中促凋亡蛋白Bax密切聯(lián)系，Bcl-2與Bax之間的比例對細(xì)胞是否發(fā)生凋亡起重要作用。崗田酸(OA)是蛋白磷酸酶抑制劑，在整體或離體條件OA能使神經(jīng)細(xì)胞微管相關(guān)蛋白tau異常高度磷酸化而使神經(jīng)細(xì)胞退化，部分模擬了AD樣病理特征。離體時OA所致神經(jīng)細(xì)胞退化為凋亡，而整體時也發(fā)現(xiàn)OA能引起神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡樣DNA雙鏈斷裂。為了研究Bcl-2相關(guān)凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制在OA所致神經(jīng)細(xì)胞退化中的影響，本課題首先采用大鼠腦額葉皮質(zhì)定位注射OA的整體模型，觀察OA致神經(jīng)細(xì)胞退化時Bcl-2和Bax的表達(dá)變化規(guī)律，探討B(tài)cl-2在OA致神經(jīng)細(xì)胞退化時的作用特征以及Bcl-2是否參與此過程中細(xì)胞自身代償性保護(hù)機(jī)制；繼而采用OA誘導(dǎo)體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡性退化的離體模型，研究Bcl-2過表達(dá)是否抑制OA所致神經(jīng)細(xì)胞退化，以進(jìn)一步確定Bcl-2在OA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞退化過程中是否具有細(xì)胞保護(hù)作用。 整體實驗部分Bcl-2在OA誘導(dǎo)大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞退化中的作用分析 為探討B(tài)cl-2相關(guān)凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制與整體時OA致神經(jīng)細(xì)胞tau蛋白高度磷酸化和退化之間的關(guān)系，采用大鼠額葉皮質(zhì)定位注射OA的模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、免疫熒光三標(biāo)結(jié)合激光共聚焦掃描的方法，檢測OA致神經(jīng)細(xì)胞退化時對Bcl-2表達(dá)和Bax表達(dá)的影響及二者與tau蛋白磷酸化的共存關(guān)系。結(jié)果如下： 1．在OA作用皮質(zhì)，神經(jīng)細(xì)胞高表達(dá)Bcl-2蛋白，OA作用皮質(zhì)表達(dá)Bcl-2的細(xì)胞數(shù)明顯增加，且具有時間和劑量反應(yīng)特征，對各時間反應(yīng)組的細(xì)胞計數(shù)顯示，注射20ng OA 12h、1d、3d時Bcl-2免疫陽性細(xì)胞的數(shù)目顯著高于相應(yīng)時間點(diǎn)的生理鹽水對照組(p＜0.001)，且OA 12h、1d、3d組與OA 3h、6h、7d組相比有顯著性差異(12h，p＜0.01；1d、3d，p＜0.05)；對注射1d時各劑量反應(yīng)組的細(xì)胞計數(shù)顯示，20ng、50ng、100ng OA組均大量表達(dá)Bcl-2蛋白，與生理鹽水對照組相比有顯著差異(20ng，p＜0.01；50ng、100ng，p＜0.05)，20ng和100ng組與10ng組相比也有顯著差異(p＜0.05)； 2．在OA作用皮質(zhì)，神經(jīng)細(xì)胞高表達(dá)Bax蛋白，且具有時間和劑量反應(yīng)特征，對各時間反應(yīng)組的細(xì)胞計數(shù)顯示，注射20ng OA 12h、1d、3d時Bax免疫陽性細(xì)胞的數(shù)目顯著高于相應(yīng)時間點(diǎn)的生理鹽水對照組(p＜0.01)；對注射1d時各劑量反應(yīng)組的細(xì)胞計數(shù)顯示，與生理鹽水對照組和10ng組相比，20ng、100ng OA組的Bax免疫陽性細(xì)胞數(shù)有增多趨勢，接近統(tǒng)計學(xué)顯著性差異水平； 3．比較OA 20ng 1d組大鼠的相鄰平面腦片AT-8、Bcl-2和Bax三種免疫組化染色，形態(tài)學(xué)觀察顯示，在OA注射皮質(zhì)，三種免疫陽性細(xì)胞的分布位置大體一致，Bcl-2陽性細(xì)胞的分布范圍和細(xì)胞數(shù)目明顯大于或多于其他兩種免疫陽性細(xì)胞，在三種免疫陽性細(xì)胞中，Bax陽性細(xì)胞的分布范圍最小，陽性細(xì)胞數(shù)目最少，AT-8陽性細(xì)胞居中；對OA 20ng 1d組大鼠的AT-8、Bcl-2和Bax免疫熒光三標(biāo)顯示，在距OA注射位點(diǎn)較近的周邊區(qū)域，Bcl-2表達(dá)與AT-8表達(dá)、Bax表達(dá)共存，或Bcl-2表達(dá)僅與AT-8表達(dá)共存；在距OA注射位點(diǎn)較遠(yuǎn)周邊區(qū)域，僅見Bcl-2高表達(dá)，未見AT-8和Bax表達(dá)。 這部分結(jié)果提示，OA上調(diào)額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，且具有時程規(guī)律和劑量反應(yīng)特征，并與OA所致tau蛋白磷酸化的時程規(guī)律和劑量反應(yīng)特征較為一致，提示OA所致Bcl-2和Bax高表達(dá)與tau蛋白磷酸化之間可能存在內(nèi)在聯(lián)系；OA作用皮質(zhì)區(qū)域，AT-8、Bcl-2、Bax表達(dá)三者共存或AT-8表達(dá)僅與Bcl-2表達(dá)二者共存，這提示Bcl-2家族活躍參與OA所致神經(jīng)細(xì)胞退化過程，，但Bcl-2、Bax高表達(dá)時的活性狀態(tài)及其對OA所誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的功能意義還有待證實。 離體實驗部分Bel-2在OA誘導(dǎo)體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞退化中的作用分析 為了進(jìn)一步探討OA致神經(jīng)細(xì)胞損傷過程中Bcl-2表達(dá)上調(diào)的功能意義，采用OA誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞退化的離體模型，應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法、DNA熒光染料Hoechst 33258染色法、MTT還原法，首先明確OA引起SH-SY5Y細(xì)胞凋亡性退化，鑒定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染引起SH-SY5Y細(xì)胞外源性過表達(dá)功能性Bcl-2，進(jìn)而研究Bcl-2過表達(dá)對OA所致體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞退化的影響。結(jié)果如下： 1．MTT還原法對細(xì)胞活力的檢測顯示，OA劑量依賴性地降低SH-SY5Y細(xì)胞活力，其中60nM／80nM／100nM OA作用24h顯著降低細(xì)胞活力(60nM、80nM，p＜0.05；100nM，p＜0.01)；Hoechst 33258染色顯示，80nM OA作用24h引起該種細(xì)胞出現(xiàn)多量核濃聚、核碎裂的凋亡樣核型； 2．脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-N1-Bcl-2和空質(zhì)粒pEGFP-N1瞬時轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率分別為2.01％和2.18％，細(xì)胞分別過表達(dá)Bcl-2-GFP和GFP蛋白，Bcl-2-GFP融合蛋白主要分布于近核的細(xì)胞胞體，而GFP蛋白則在胞質(zhì)和胞核中均有分布；Hoechst 33258染色法顯示，200nM促凋亡劑星形孢菌素(STS)作用細(xì)胞24h，Bcl-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率顯著低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率(p＜0.01)； 3．Hoechst 33258染色法顯示，80 nM OA作用細(xì)胞24h，Bcl-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率顯著低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率(p＜0.05)。 這部分結(jié)果提示，OA劑量依賴性引起體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y凋亡性退化，Bcl-2重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染引起該種細(xì)胞過表達(dá)功能性融合蛋白Bcl-2-GFP，Bcl-2過表達(dá)能部分抑制OA所致SH-SY5Y細(xì)胞退化，這顯示Bcl-2在OA所致神經(jīng)細(xì)胞退化過程中可能起重要的調(diào)節(jié)作用，Bcl-2表達(dá)上調(diào)在OA損傷通路中具有細(xì)胞保護(hù)作用。 結(jié)論 1．大鼠腦額葉皮質(zhì)定位注射OA能誘導(dǎo)該區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)上調(diào)，且呈時間和劑量反應(yīng)特征，二者的表達(dá)上調(diào)可能與OA致tau蛋白高度磷酸化有關(guān)，OA作用皮質(zhì)區(qū)域AT-8、Bcl-2、Bax表達(dá)三者共存或AT-8表達(dá)僅與Bcl-2表達(dá)二者共存，這提示Bcl-2家族活躍參與OA所致神經(jīng)細(xì)胞退化過程。 2．外源性Bcl-2高表達(dá)能部分抑制OA所致體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y凋亡性退化，提示Bcl-2相關(guān)凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制參與了OA所致神經(jīng)細(xì)胞退化過程，在該損傷通路中Bcl-2表達(dá)上調(diào)具有細(xì)胞保護(hù)的功能意義。 3．綜合分析整體與離體實驗的結(jié)果，提示Bcl-2相關(guān)凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制參與OA所致神經(jīng)細(xì)胞退化過程，OA引起的Bcl-2表達(dá)上調(diào)可能是機(jī)體神經(jīng)細(xì)胞針對損傷信號的自身代償性保護(hù)機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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1 魏建設(shè),張玲妹,黃婭琳,楊增進(jìn),孫鳳艷;岡田酸誘導(dǎo)大鼠腦tau蛋白磷酸化和神經(jīng)細(xì)胞退化[J];中國神經(jīng)科學(xué)雜志;2002年03期

本文編號：2708410