【摘要】：目的： 阿片類藥物濫用已經(jīng)成為全球性的公害；近幾十年來,全世界吸毒人數(shù)持續(xù)增加,而女性吸毒人數(shù)近年呈上升趨勢,她們多為或將要進入育齡期的婦女。母親吸毒,尤其在孕期吸毒,可對胎兒及新生兒產(chǎn)生嚴重影響。阿片類藥物可以通過作用于胎盤而影響胎兒的生長發(fā)育,但未有研究發(fā)現(xiàn)其可直接影響蛻膜基質細胞的生長增殖。因此本課題在研究雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)以及u阿片受體(μ-opioid receptor,MOR)存在于人蛻膜基質細胞(decidual stromal cell,DSC)的基礎上,用嗎啡干預體外培養(yǎng)的人早孕蛻膜基質細胞,觀測基質細胞ERmRNA,PRmRNA. MORmRNA表達的變化,通過探討外源性阿片類藥物對蛻膜基質細胞的直接作用,為進一步尋求減少或阻斷嗎啡依賴對孕婦及胎兒的負面影響提供一定的思路,從而探究阿片類藥物對妊娠的影響。材料及方法： 留取2009年11月到2010年1月山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)院婦產(chǎn)科人流室提供正常妊娠6—9周行人工流產(chǎn)的蛻膜組織8例,并征得患者的知情同意。孕婦健康無合并癥。年齡20-30歲,B超證實為宮內妊娠。取得蛻膜組織,以無菌瓶收集,并立即送到實驗室,用胰蛋白酶及EDTA消化并進行全組分蛻膜細胞培養(yǎng),利用傳3代的方法對蛻膜基質細胞進行分離提純。將培養(yǎng)出的基質細胞通過催乳素(prolactin,PRL)免疫組織化學染色,及逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法進行鑒定；參考相關文獻,將所培養(yǎng)的細胞分為6組,分別是對照組(空白對照)；嗎啡極低劑量組(單純加入嗎啡,終濃度為10-7mol·L-1)；嗎啡低劑量組(單純加入嗎啡,終濃度為10-6mol·L-1)；嗎啡中劑量組(單純加入嗎啡,終濃度為10-5mol·L-1)；嗎啡高劑量組(單純加入嗎啡,終濃度為10-4mol·L-1)；嗎啡+納洛酮組(提前加入納洛酮孵育1h,再加入嗎啡,二者的終濃度為10-5mol·L-1)。首先通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測各試驗組在不同的時間內蛻膜基質細胞增殖情況,再采用RT—PCR法,利用樣本與β-actin的灰度比值,計算出各試驗組ERmRNA、PRmRNA、MORmRNA的表達水平。 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(x±s)表示,采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對MTT增殖試驗結果進行5×3析因設計的方差分析,對RT-PCR結果進行單因素方差分析和LSD檢驗,比較量效關系時用對數(shù)線性相關分析；以α=0.05為檢驗水準。結果： (一)人蛻膜基質細胞懸浮時呈典型的卵圓形,接種24h后細胞大部分已貼壁,貼壁生長的細胞為纖維母細胞狀。培養(yǎng)6-7天細胞貼壁匯合可進行傳代培養(yǎng),傳代后的蛻膜細胞生長迅速,4-5天傳代1次,倒置顯微鏡下可見細胞形態(tài)均一,呈較細長的梭形或不規(guī)則星形,核呈卵圓形,位于細胞中央,核仁清晰,有豐富的胞質顆粒。采用傳3代的方法對蛻膜基質細胞進行分離提純,經(jīng)PRL免疫組化鑒定,90%以上的細胞胞漿被染成棕黃色至深棕色,胞核未見染色。RT-PCR法顯示分離培養(yǎng)的細胞表達ERmRNA、PRmRNA。說明利用酶消化及傳3代的方法可方便地從人蛻膜組織中獲得大量、高純度的人蛻膜基質細胞,并保持了其在體內的功能,可用于進一步的研究。 (二)結合MTT結果,嗎啡的濃度和生長時間對基質細胞的增殖都有影響,在相同的時間點隨著嗎啡濃度的增加OD值減少(P0.05),表明嗎啡濃度越大對基質細胞增殖的抑制作用越強；在不同的時間點里基質細胞的增殖速度不同(P0.05),尤其是在嗎啡干預后的24h-48h增殖差異最顯著(P0.05),用藥后24h-72h隨時間增加,細胞計數(shù)增加。 (三)RT—PCR結果顯示：ERmRNA、PRmRNA、MORmRNA和內參β-actin的基因產(chǎn)物分別在249bp、196bp、342bp、307bp處出現(xiàn)特異性擴增條帶。不同濃度嗎啡組的ERmRNA、PRmRNA、MORmRNA表達分別與對照組及嗎啡+納洛酮組之間比較均有統(tǒng)計學意義(P0.001),且隨著嗎啡濃度的減少人蛻膜基質細胞內ERmRNA、PRmRNA、MORmRNA表達增加,二者之間呈負相關(r=-0.991,P0.001；r=-0.981,P0.001；r=-0.992,PO.001)。 結論： 人蛻膜基質細胞上存在u-阿片受體；在細胞水平上,嗎啡對人蛻膜基質細胞增殖有直接的抑制作用，，而這種作用一定程度上可被特異性阿片受體拮抗劑納洛酮抑制。在分子水平上,嗎啡可直接使人蛻膜基質層細胞ERmRNA、PRmRNA、MORmRNA表達下降,且呈劑量依賴性下調。
【圖文】：

09令01圖1:圖2:嗎啡濃度與ERmRNA/p一actin的散點圖令令令令Q甘丁矛

本文編號：2707992