【摘要】：目的：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是老年人群常見(jiàn)的漸進(jìn)性神經(jīng)退行性疾病。臨床及實(shí)驗(yàn)研究已確定3種導(dǎo)致早發(fā)家族性AD (FAD)的基因,即淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)、早老素-1(presenilin 1, PS-1)和早老素-2(presenilin 2, PS-2)。目前已有AD家系的基因突變數(shù)據(jù)大都來(lái)自國(guó)外,國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。為了解國(guó)內(nèi)FAD的致病基因突變情況,本研究對(duì)部分中國(guó)人群中上述三個(gè)基因的突變熱點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析；對(duì)于新發(fā)突變,進(jìn)行初步的分子機(jī)制研究。 方法：收集AD患者及其親屬的外周血樣本,提取基因組DNA,針對(duì)PS-1和PS-2基因的編碼外顯子和APP外顯子16、17設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增基因外顯子后測(cè)序篩選相關(guān)基因突變。對(duì)于檢測(cè)到的新發(fā)突變,采用Megaprimer-PCR法構(gòu)建相應(yīng)基因的cDNA突變體和真核表達(dá)質(zhì)粒載體,經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株；為在神經(jīng)細(xì)胞中高效表達(dá)和研究FAD突變體的致病機(jī)理,本研究構(gòu)建了重組腺病毒穿梭質(zhì)粒,Pme I線性化后轉(zhuǎn)化AdEasier(含有pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183)感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒,經(jīng)Pac I酶切乙醇沉淀后脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞包裝重組腺病毒,并用Western Blot進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：AD臨床樣本致病基因的測(cè)序結(jié)果顯示本研究篩選到一個(gè)PS-1基因的突變(R278I)和一個(gè)APP基因的新突變(K724X)。構(gòu)建的APP695野生型及突變型真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-APP695WT、pcDNA3.1(-)-APP695K724X和pcDNA3.1 (-)-APP695K724N經(jīng)過(guò)了菌液PCR和測(cè)序鑒定,獲得了相應(yīng)的HEK293穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。構(gòu)建的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-APP695WT、pAd-APP695K724X和pAd-APP695K724N,經(jīng)過(guò)了菌液PCR和測(cè)序鑒定,Western Blot鑒定結(jié)果顯示重組腺病毒包裝成功。 結(jié)論：本研究篩選到一個(gè)PS-1基因的突變(R278I)和一個(gè)新的導(dǎo)致FAD的APP基因突變(K724X)；構(gòu)建了APP695相應(yīng)的真核表達(dá)載體,建立了穩(wěn)定表達(dá)HEK293細(xì)胞株；構(gòu)建并成功包裝了重組腺病毒,為深入研究FAD的發(fā)病機(jī)制和藥物篩選奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖1.APP水解模式圖Fig.1.SehematieillustrationoftheamyloidogenieandnonamyloidogenieAPPProeessingPathwaysa分泌酶屬于AnAMs(adisinteginandmetalloproreinases)家族，，至今鑒定出來(lái)的a分泌酶的候選蛋白有AoAMg走’81，ADAM101’”]和ADAM一7[20](又稱tumor

圖2.基因突變篩選及APP表達(dá)載體構(gòu)建的流程圖Fig.2.Thesehemeofsereeninggenemutationandeo一lstruetionofAPPexPressionveeProtoeol
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 賈建平,許二赫;家族性Alzheimer病淀粉樣蛋白前體基因第16、17外顯子的突變分析[J];腦與神經(jīng)疾病雜志;2003年04期

2 方伯言;賈建平;;中國(guó)人早老素-1突變基因?qū)H-SY5Y細(xì)胞凋亡易感性的影響[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年05期

本文編號(hào)：2703142