【摘要】：隨著近年來科技的發(fā)展,對于極端環(huán)境來源的微生物的研究得到廣泛關(guān)注。其中在快速發(fā)展的酶學(xué)領(lǐng)域中,嗜熱微生物來源的酶不僅在高溫環(huán)境下具有良好的穩(wěn)定性,而且具有令人驚奇的潛在催化能力,此類特性為探索新的生物催化劑的研發(fā)與應(yīng)用提供了新選擇。源自嗜熱古菌的酰基氨肽酶具有較高的研究價值,已有報道其在合成應(yīng)用中展現(xiàn)出良好的非專一性催化合成C-C鍵的能力,且在清除細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)中起著關(guān)鍵作用。有鑒于此,我們利用本實驗室自主克隆表達(dá)的一系列酰基氨肽酶,進(jìn)行了以下三方面研究:(1)考察�；彪拿傅母脑鞂Y(jié)構(gòu)功能的影響并篩選性能優(yōu)良的突變體,研究酶的結(jié)構(gòu)特性,提高非專一性催化Aldol加成反應(yīng)的產(chǎn)率及催化效率;(2)設(shè)計和構(gòu)建近紅外響應(yīng)型嗜熱酰基氨肽酶納米材料復(fù)合體體系,探究該體系在實時調(diào)控催化Aldol加成反應(yīng)中的應(yīng)用;(3)探究嗜熱�；彪拿冈诎柎暮ＤY治療方面的應(yīng)用,提出酶與靶向單鏈抗體聯(lián)用的治療策略,最終構(gòu)建靶向嗜熱酰基氨肽酶納米材料復(fù)合體,實現(xiàn)其在阿爾茨海默癥治療及預(yù)防方面的應(yīng)用。首先我們選擇了本實驗室已經(jīng)成功表達(dá)的具有不同最適催化溫度的酰基氨肽酶(中溫酰基氨肽酶BSU32230、嗜熱酰基氨肽酶ST0779、超嗜熱酰基氨肽酶APE1547)作為研究對象,通過同源比對及結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果分析,推測�；彪拿傅臉蚪咏Y(jié)構(gòu)元件對酶結(jié)構(gòu)與功能所起的作用,但目前針對該類酶的結(jié)構(gòu)元件的相關(guān)報道較少。橋接結(jié)構(gòu)元件是連接兩個結(jié)構(gòu)域的樞紐結(jié)構(gòu),由兩個結(jié)構(gòu)元件組成,包括直接連接兩個結(jié)構(gòu)域的linker區(qū)和由N端伸向C端催化結(jié)構(gòu)域的N-末端α螺旋。本文通過在linker區(qū)中插入或敲除氨基酸來改造該區(qū)域,重點研究橋接結(jié)構(gòu)的linker區(qū),結(jié)果顯示linker區(qū)直接影響酶的穩(wěn)定性和催化性能。說明橋接結(jié)構(gòu)元件對酶催化性能影響較大,其對酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也起著至關(guān)重要的作用。本文通過對橋接結(jié)構(gòu)理性改造設(shè)計,成功篩選出具有良好穩(wěn)定性、更佳催化能力的突變體ST-4A,提高了催化Aldol反應(yīng)的產(chǎn)率,有利于化學(xué)合成領(lǐng)域的應(yīng)用。另一方面,本文選擇嗜熱酰基氨肽酶APE1547及ST0779作為研究對象,來構(gòu)建實時調(diào)控、高效率、高特異性、高反應(yīng)可控性的低能耗催化系統(tǒng)。通過構(gòu)建嗜熱酰基氨肽酶偶聯(lián)金納米材料復(fù)合體,利用近紅外光激發(fā)納米金的光熱效應(yīng),實現(xiàn)局部快速遞能以激活酶轉(zhuǎn)化至活性狀態(tài)并加熱反應(yīng)體系,最終應(yīng)用于非專一性催化Aldol反應(yīng)。其中該體系實現(xiàn)酶實時調(diào)控催化,即通過近紅外光照射作為反應(yīng)的開關(guān),快速開啟和終止酶催化反應(yīng),實現(xiàn)反應(yīng)實時可控。該體系能有效提高酶非專一性催化Aldol有機反應(yīng)催化速率,催化速率提高8倍。構(gòu)建的復(fù)合體具有較好的可重復(fù)利用性和高穩(wěn)定性,本文成功構(gòu)建了實時調(diào)控固定化酶的催化體系。此外,由于其在清除細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)中起著關(guān)鍵作用,�；彪拿妇哂休^高的生物醫(yī)學(xué)研究價值,已有報道人源酰基氨肽酶可作為潛在的Aβ降解酶,有效清除體內(nèi)毒性Aβ的能力,在治療阿爾茨海默癥中具有潛在應(yīng)用價值。目前人源�；彪拿讣兓蠓�(wěn)定性低,后續(xù)應(yīng)用研究難度較大,阻礙其進(jìn)一步用于藥物的研發(fā)。因此,基于酰基氨肽酶潛在的應(yīng)用價值,有望通過該家族同功能屬性的外源�；彪拿高M(jìn)行深入研究及新藥研發(fā)。在本研究中,我們嘗試?yán)脕碜杂诒緦嶒炇业氖葻狨；彪拿窼T0779,檢測發(fā)現(xiàn)其能有效降解Aβ多肽,降低Aβ介導(dǎo)的相關(guān)毒性�；诖�,進(jìn)一步提出嗜熱酰氨肽酶ST0779和單鏈抗體12B4聯(lián)合給藥治療策略,發(fā)現(xiàn)能更好的降解Aβ單體、解聚毒性寡聚體并抑制Aβ介導(dǎo)的相關(guān)毒性,具有良好的治療效果。最終構(gòu)建了靶向酰氨基肽酶納米材料復(fù)合體,并輔以近紅外光實時調(diào)控以加強治療效果,實現(xiàn)在阿爾茨海默癥線蟲模型中降解Aβ并抑制Aβ介導(dǎo)的相關(guān)毒性,延緩線蟲癱瘓率,獲得一定的治療效果。此項工作對�；彪拿高M(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究,揭示了橋接結(jié)構(gòu)元件與催化機理之間的關(guān)系,并篩選出穩(wěn)定性、催化性能更佳的突變體,為�；彪拿傅耐蛔兏脑扉_創(chuàng)了新的方向,展現(xiàn)出酰基氨肽酶催化有機合成反應(yīng)的應(yīng)用潛力;另一方面,構(gòu)建納近紅外光照射實時調(diào)控催化體系,應(yīng)用于催化Aldol反應(yīng),展現(xiàn)�；彪拿冈诤铣蓱�(yīng)用中的潛在價值。最后,探究嗜熱酰基氨肽酶在降解Aβ中的作用,提出嗜熱酰氨肽酶ST0779和單鏈抗體12B4聯(lián)合給藥治療策略,發(fā)現(xiàn)能更好的作用于Aβ并抑制Aβ介導(dǎo)的相關(guān)毒性,對阿爾茨海默癥的治療效果良好。通過以上研究,成功構(gòu)建了靶向酰氨基肽酶納米材料復(fù)合體,輔以近紅外光實時調(diào)控加強了治療效果,實現(xiàn)在線蟲模型中降解Aβ的應(yīng)用,延緩線蟲的癱瘓情況。為阿爾茨海默病多功能藥物研發(fā)提供了新策略,揭示了嗜熱�；彪拿冈诎柎暮ＤY方面的應(yīng)用價值,為嗜熱古細(xì)菌作為新型藥物的應(yīng)用彰顯出巨大潛能。
【圖文】：

保守的組氨酸位于最后 β 片層尾端。�；彪拿复呋�(lián)體通常由 S活性位點絲氨酸附近存在保守序列 G-X-S-X-G，，其催化三聯(lián)體序列與一致。催化三聯(lián)體是酶催化活性的核心，其利用堿性氨基酸與酸性氨絲氨酸進(jìn)攻底物，促使底物與酶形成過渡態(tài)共價體，利于后續(xù)催化過解肽鍵的過程實質(zhì)為加成反應(yīng)和消除反應(yīng)，關(guān)鍵的四面中間體的形成利進(jìn)行[6-7]。氨肽酶家族推進(jìn)器結(jié)構(gòu)域也至關(guān)重要，其由七個 β 片層組成的具有過可阻止大分子蛋白進(jìn)入催化中心結(jié)構(gòu)。因此，�；彪拿讣易鍩o法水鏈，通常只能水解 30-55 個氨基酸組成的短肽。這說明該推進(jìn)器結(jié)構(gòu)族的底物特異性。近年來，酶分子晶體結(jié)構(gòu)也證實推進(jìn)器結(jié)構(gòu)域位于進(jìn)器結(jié)構(gòu)的內(nèi)部空腔直徑恰巧小于催化中心開口，有底物存在時，推改變而分開，這種現(xiàn)象說明該結(jié)構(gòu)域是底物進(jìn)入活性位點的通道，能長鏈肽的意外水解，保證其催化功能的正常發(fā)揮[9-11]。

79[12-13]。根據(jù) APE1547 的三維結(jié)構(gòu)、結(jié)合蛋白模擬、突變改造和化學(xué)修飾人們能夠更精準(zhǔn)地闡明結(jié)構(gòu)與催化功能之間的關(guān)系，優(yōu)化催化性能及應(yīng)用當(dāng)前研究表明，嗜熱�；彪拿赣啥垠w組成，單體由 C 端催化結(jié)構(gòu)域和組成，兩個結(jié)構(gòu)域間由橋梁結(jié)構(gòu) linker 直接連接。同時，N 端結(jié)構(gòu)域的末端 C 端的催化結(jié)構(gòu)域表面，該結(jié)構(gòu)對酶也起到連接兩個結(jié)構(gòu)域的作用。究頗為深入，模擬結(jié)構(gòu)及突變研究顯示，其中 N 端推進(jìn)器結(jié)構(gòu)域的末端 ，影響酶的催化能力和穩(wěn)定性。該 α1 螺旋的疏水氨基酸對催化口袋的長程進(jìn)而影響酶的催化性能。目前對于其它酰基氨肽酶家族成員的深入研究較為針對更多該家族成員的探究意義較大，揭示該家族結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的也至，嗜熱�；彪拿傅膽�(yīng)用逐漸得到研究者的關(guān)注。值得注意的是，�；� C-C 鍵合成反應(yīng)效果較為突出。本課題組曾報道 ST0779 在催化 C-C 加成催化性能，是目前催化 Aldol 反應(yīng)速率最快的酶[12]（圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R749.16;Q814

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