【摘要】： 阿爾采末病(AD)是最常見的以進行性記憶減退、認知障礙為特征的神經(jīng)退行性疾病,其病理改變的主要特征是在大腦皮層和海馬區(qū)域出現(xiàn)大量的老年斑(SP)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NTF)以及神經(jīng)元的大量丟失。SP是由β—淀粉樣蛋白(Aβ)在細胞外沉積而成,周圍伴有營養(yǎng)不良的神經(jīng)突、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞。NFT的主要成分是雙螺旋纖維細絲(PHF),它是由tau蛋白過度磷酸化后形成。tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白主要存在于軸突內(nèi),由17號染色體(FTDP—17)的單基因編碼。tau蛋白的主要功能是促進微管的形成和保持微管的穩(wěn)定性。研究表明,tau蛋白磷酸化程度是體內(nèi)多種蛋白激酶的磷酸化和蛋白磷酸酶的脫磷酸化兩種作用平衡的結(jié)果。實驗證實有四種蛋白磷酸酶(PPs),包括PP1,PP2A,PP2B和PP2C,在體外均可以使tau去磷酸化。其中,PP2A是腦內(nèi)調(diào)節(jié)tau蛋白去磷酸化主要的磷酸酶。岡田酸(Okadaic acid,OA)是一種海洋生物提取物,對PP2A有抑制作用。體外研究表明,OA能使神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白tau異常過度磷酸化,過度磷酸化產(chǎn)生神經(jīng)毒性,包括產(chǎn)生AD樣的病理過程。 對AD病人的尸檢發(fā)現(xiàn),AD患者大腦皮層的枕葉在發(fā)病過程很少受累,這一現(xiàn)象引起了日本學者Hashimoto教授及其同事的濃厚興趣,通過對這一腦區(qū)建立的cDNA文庫的分析,最終于2001年發(fā)現(xiàn)了一種由24個氨基酸組成的線性多肽并將其命名為Humanin(HN)。研究發(fā)現(xiàn),HN可以抑制APP、PS1、PS2突變誘發(fā)的神經(jīng)元死亡,拮抗Aβ完整肽鏈及Aβ片斷誘導的神經(jīng)毒作用,而對其他原因的毒性似乎不表現(xiàn)保護作用。因此,發(fā)現(xiàn)者將其定義為AD特異性或AD相關(guān)毒性(AD related insults)的神經(jīng)保護肽。但隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)HN可通過降低Ca~(2+)超載而維持胞內(nèi)Ca~(2+)穩(wěn)態(tài);通過提高ATP改善細胞功能;通過抑制Bax由胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體,抑制線粒體途徑的凋亡;通過抑制JNK-c-jun及FasL的表達,抑制死亡受體途徑的凋亡。本研究室的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),HN可以拮抗NMDA所致的興奮毒、還可以拮抗缺氧所致的皮層神經(jīng)元損傷。上述結(jié)果提示,HN很可能是一種具有廣泛保護作用的神經(jīng)保護因子。本研究擬觀察HN拮抗OA通過誘導tau蛋白過度磷酸化所致的神經(jīng)毒是否具有保護作用。 實驗包括兩個部分,第一部分為HN拮抗OA誘導皮層神經(jīng)元毒性作用的觀察(LDH、MTT檢測和Calcein—AM染色)。第二部分為HN拮抗OA誘導皮層神經(jīng)元凋亡的作用觀察。 第一部分Humanin拮抗岡田酸誘導皮層神經(jīng)元毒性作用的觀察 本部分實驗首先觀察OA引起的大鼠皮層神經(jīng)元的毒性作用,在此基礎上觀察HN對OA所致毒性作用的影響。OA的毒性作用通過兩方面的指標觀察,一是測定與細胞損傷相關(guān)的物質(zhì)變化如乳酸脫氫酶(LDH)的含量,通常情況下細胞內(nèi)的LDH很少釋放,而當細胞受損后會引起LDH的大量釋放,因此LDH測定可反映神經(jīng)細胞損傷程度。另一指標體系是細胞活力的檢測,包括MTT細胞活力分析及Calcein-AM染色反映活細胞數(shù)量,它們都可用來反映細胞活力從而確定細胞在OA毒性作用下細胞活力的降低及確定HN的神經(jīng)保護作用。 實驗結(jié)果: 一、LDH檢測: 1.OA引起上清液中的LDH升高: 分別加入不同濃度的OA(5、10、20hM)作用于培養(yǎng)細胞,隨著OA濃度的增加,其毒性作用也逐漸顯現(xiàn),且呈現(xiàn)劑量依賴性。在倒置顯微鏡下即可直接觀察到培養(yǎng)神經(jīng)元受OA作用后形態(tài)的改變,如胞體折光性下降,突起回縮明顯,甚至斷裂溶解成碎片。上清液中LDH檢測結(jié)果顯示,5nM OA與對照組無明顯差別,但10nM OA即可引起LDH的明顯升高157.754±9.010(P＜0.05),20hM OA的損傷作用最強183.714±6.065(P＜0.05)。 2.HN拮抗OA引起的LDH升高發(fā)揮保護作用: 預先應用5μM的HN未能抑制OA引起的LDH升高,而10μM HN可降低OA引起的LDH升高141.862±6.901(P＜0.05),20μM HN可顯著降低OA引起的LDH升高,由157.754±9.010降至126.352±6.511(P＜0.01)。 二、細胞活力檢測: 1.MTT活性分析: (1)OA引起MTT水平降低: 檢測結(jié)果與LDH基本相同,加入OA后,細胞活力顯著降低,10nM、20nM的OA引起細胞活力從100%下降為72.71±6.82%(P＜0.05)和53.22±4.48%(P＜0.05),表現(xiàn)為MTT水平降低。隨著濃度的增加,表現(xiàn)作用逐漸增強,20nM的OA毒性作用最強。 (2)HN拮抗OA引起的MTT降低發(fā)揮神經(jīng)保護作用: 預先應用5州HN未能抑制OA引起的MTT降低,但101μM HN即可發(fā)揮拮抗作用,使細胞存活率由損傷后的72.71±6.82%升高到82.07±4.68%(P＜0.05);20μM HN則明顯抑制OA的損傷作用,使細胞存活率由損傷后的72.71±6.82%升高到93.18±7.22(P＜0.01),基本恢復正常。 2.Calcein—AM染色分析: 應用Calcein—AM染色進行細胞活力分析的結(jié)果顯示,OA作用后使Calcein—AM染色的陽性細胞明顯減少,即有活力的細胞明顯減少。預先應用5μM HN無明顯的保護作用,10μM HN可抑制OA引起的損傷,20μM HN的保護作用明顯增強,表現(xiàn)為Calcein—AM陽性染色的細胞明顯增加,接近正常水平。 上述結(jié)果提示: 1.OA對培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用,表現(xiàn)為上清液LDH升高,細胞活力降低包括MTT水平降低及Calcein—AM染色的有活力細胞減少; 2.HN可拮抗OA引起的細胞毒發(fā)揮神經(jīng)保護作用。 第二部分Humanin拮抗岡田酸誘導皮層神經(jīng)元凋亡的作用觀察 OA通過抑制PP2A而引起tau蛋白過度磷酸化,除引發(fā)上述毒性作用外還可導致神經(jīng)元產(chǎn)生凋亡。上述研究表明,HN可以拮抗OA誘導的神經(jīng)毒發(fā)揮保護作用,那么HN是否是通過抑制OA誘導的凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用呢?本部分實驗在證實OA誘導凋亡(采用Caspase3和TUNEL檢測)的基礎上,觀察HN具有的神經(jīng)保護作用。 實驗結(jié)果: 一、Caspase3活性檢測: 1.OA引起Caspase3的活性增加: 分別加入不同濃度的OA(5、10、20nM)作用于培養(yǎng)細胞,隨著OA濃度的增加,其毒性作用也逐漸顯現(xiàn),且呈現(xiàn)劑量依賴性。在倒置顯微鏡下即可直接觀察到培養(yǎng)神經(jīng)元受OA作用后形態(tài)的改變,如胞體折光性下降,突起回縮明顯,甚至斷裂溶解成碎片。Caspase3檢測結(jié)果顯示,5nM OA與對照組無明顯差別,但10nM OA即可引起Caspase3活性增加到0.1420±0.01022(P＜0.05),而20nM的OA作用最強,OD值為0.1784±0.00942(P＜0.01)。 2.HN保護作用的觀察: 預先應用5μM的HN未能抑制OA引起的Caspase3活性增加,而10μM HN可降低OA引起的Caspase3活性增加,其OD值為0.1288±0.00512(P＜0.05),20μM HN可顯著降低OA引起的Caspase3活性增加,其OD值為0.0990±0.01079(P＜0.01)。 二、TUNEL染色: TUNEL的熒光染色顯示,OA誘導凋亡的細胞核呈均勻或不均勻“圓形”或“新月形”綠色熒光,未凋亡細胞核為藍色。10nM OA組培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡指數(shù)(30.95±2.27%)較對照組凋亡指數(shù)(5.75±0.65%)顯著增加,具有顯著性差異(P＜0.05)。預先應用μMHN未能抑制OA引起的凋亡,10μM HN可以使凋亡指數(shù)從30.95±2.27%降低到24.84±2.20%(P＜0.05),20μM HN對凋亡的保護作用更顯著,可以使凋亡指數(shù)由受損后的30.95±2.27%降低到14.71±1.32%(P＜0.01)。 上述結(jié)果提示: 1.OA可誘導皮層神經(jīng)元引起凋亡; 2.HN可拮抗OA引起的神經(jīng)元凋亡,從而發(fā)揮保護作用。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學碩士學位論文細胞系Ell.5可以分化成MAPZ陽性細胞和星形膠質(zhì)細胞網(wǎng)，鼠的皮層神經(jīng)前體表達Wnt一7a或者是日一連環(huán)蛋白的穩(wěn)定型占優(yōu)勢時，在體外與神經(jīng)元是有區(qū)別體實驗wnt/p一連環(huán)蛋白的抑制可以阻止發(fā)育中的鼠新大腦皮層的分化圈。這些了Wnt/p一Catenin信號與正常神經(jīng)元在動態(tài)過程中的功能是密切相關(guān)的，如神分化過程。Wnt/p一Catenin途徑有多種作用，，參與了發(fā)育過程中的神經(jīng)元有絲例如APC介導煙堿型乙酞膽堿受體(nAchR)的聚集〔152〕(圖3)，通過集聚蛋白受經(jīng)肌肉接頭處的成熟，MuSK〔68〕和加固突觸接觸部位【‘2〕。A22kl124351

Wnt一7a的活化增加了APC與
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R749.16

【引證文獻】

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1 馬國英;楊小榮;趙欣;趙晉楓;秦華平;史瑞紅;張策;;Humanin對STZ誘導培養(yǎng)的皮層神經(jīng)細胞損傷的保護作用[J];中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志;2010年12期

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1 馬國英;鏈脲佐菌素致原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元損傷作用以及吡格列酮和Humanin的保護作用觀察[D];山西醫(yī)科大學;2010年

本文編號：2683735