【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其主要病理變化是腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元大量丟失和死亡。研究表明在AD病人腦組織中有大量p淀粉樣蛋白(Aβ)沉積。作為細(xì)胞存活和功能的重要細(xì)胞器,以往研究已經(jīng)證實(shí)線粒體的形態(tài)、運(yùn)動(dòng)和功能在AD時(shí)會(huì)受到影響,但關(guān)于其運(yùn)動(dòng)的長(zhǎng)時(shí)程連續(xù)動(dòng)態(tài)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。另外,研究也表明AD病人腦內(nèi)存在膽堿能系統(tǒng)功能異常,而囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體(vesicular acetylcholine transporter, VAChT)是膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分,已有文獻(xiàn)通過(guò)免疫組化和放射免疫方法證實(shí)AD病人腦內(nèi)VAChT表達(dá)降低,但關(guān)于該囊泡的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)過(guò)程及在疾病中的作用的研究較少,且研究手段較單一。根據(jù)AD的相關(guān)病理變化和發(fā)病機(jī)制,目前臨床上主要采用膽堿酯酶抑制劑治療AD,加蘭他敏就是其中的一種。關(guān)于其作用機(jī)制,已有研究證實(shí)它能夠抑制Ap聚集、氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡等。但是,加蘭他敏具體的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制還沒(méi)有完全清楚,有待進(jìn)一步探討。 本論文首先用Ap蛋白活性片段Aβ25-35誘導(dǎo)高分化PCI2細(xì)胞凋亡建立AD體外細(xì)胞模型,確定20μM Aβ25-35作用24 h為造模的最佳條件。然后在該模型基礎(chǔ)上,利用激光共聚焦顯微技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光酶標(biāo)儀、活細(xì)胞工作站、全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)、熒光染料染色、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、分子生物學(xué)技術(shù)和計(jì)算機(jī)圖像處理等,對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體運(yùn)動(dòng)和功能變化、VAChT運(yùn)動(dòng)和蛋白表達(dá)變化及加蘭他敏的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)Aβ25-35可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體形態(tài)運(yùn)動(dòng)和功能異常,在Aβ25-35作用早期,線粒體動(dòng)力學(xué)改變是可逆的,依賴于暴露的時(shí)間和藥物濃度；(2)正常情況下PC12細(xì)胞中單個(gè)囊泡在膜融合之前的轉(zhuǎn)運(yùn),發(fā)現(xiàn)VAChT囊泡的運(yùn)動(dòng)主要有3種類型,分別為單個(gè)囊泡沿一條軌跡長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)、多個(gè)囊泡沿同一條軌跡運(yùn)動(dòng)和單個(gè)囊泡沿一條軌跡的雙向往返運(yùn)動(dòng),且以第1種運(yùn)動(dòng)類型最為常見(jiàn)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了Aβ25-35對(duì)VAChT運(yùn)動(dòng)的影響,發(fā)現(xiàn)20μM Aβ25-35作用24 h能明顯抑制VAChT運(yùn)動(dòng)。同時(shí)檢測(cè)到Aβ25-35能顯著抑制VAChT蛋白的表達(dá)；(3)加蘭他敏能抑制Aβ25-35聚集、Aβ25-35誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GADD153和Grp78/94表達(dá)上升和下游的caspase-12活化增加。另外加蘭他敏也能抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的線粒體膜電位崩解、ROS產(chǎn)生、細(xì)胞色素c釋放、Bcl-2/Bax比值下降和隨后的caspase-9活化,最終抑制caspase-3活化,降低細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果提示線粒體和VAChT在AD發(fā)生過(guò)程中起了重要作用,并且加蘭他敏通過(guò)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩條通路發(fā)揮了抗凋亡及神經(jīng)保護(hù)作用；為進(jìn)一步理解AD的病理機(jī)制提供了理論基礎(chǔ),也為相關(guān)藥物研發(fā)提供了新的藥物靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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