【摘要】：目的:阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease,AD)是常見的神經(jīng)退行性疾病。其最主要的臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙,如記憶能力的漸進(jìn)性減退等。銅的神經(jīng)毒性能夠加速AD的發(fā)生與發(fā)展,而細(xì)胞核功能紊亂可能是銅導(dǎo)致AD的重要因素之一,但是目前對(duì)于銅是怎樣影響細(xì)胞核功能,加速AD進(jìn)程尚不清楚。本文旨在利用細(xì)胞核蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),初步確認(rèn)低劑量銅暴露對(duì)WT小鼠和3xTg-AD小鼠海馬細(xì)胞核蛋白質(zhì)組的影響,篩選出參與該過程的關(guān)鍵分子。方法:給實(shí)驗(yàn)組6月齡野生型(Wild type,WT)小鼠和三轉(zhuǎn)基因AD(3xTg-AD,Tg)小鼠喂養(yǎng)含0.13ppm氯化銅的飲用水,同時(shí)以未暴露于銅的3xTg-AD和WT小鼠作為對(duì)照組。2個(gè)月后,用乙醚對(duì)動(dòng)物進(jìn)行安樂死處理。首先,采用8-OHdG(8-hydroxyguanosine)免疫熒光、Tunel染色等方法驗(yàn)證銅對(duì)WT小鼠和3xTg-AD小鼠神經(jīng)元損傷情況,采用ATP酶活力檢測(cè)方法,測(cè)定AD小鼠腦組織ATP水平。隨之利用熒光差異雙向凝膠電泳(two-dimensional fluorescence differencegel electrophoresis,2D-DIGE)結(jié)合質(zhì)譜分析的方法,探究低劑量銅暴露對(duì)WT小鼠和3xTg-AD小鼠海馬細(xì)胞核蛋白質(zhì)組的影響。最后,使用Western blot和免疫組化試驗(yàn)對(duì)差異蛋白進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果:免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,低劑量銅暴露導(dǎo)致3xTg-AD小鼠海馬神經(jīng)元DNA損傷加劇;TUNEL染色結(jié)果表明,低劑量銅暴露引起神經(jīng)元凋亡數(shù)量增加。2D-DIGE結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果表明,與WT小鼠相比,在3xTg-AD小鼠海馬細(xì)胞核中共發(fā)現(xiàn)37個(gè)差異表達(dá)的蛋白;未暴露銅WT小鼠與銅暴露WT小鼠相比,共發(fā)現(xiàn)46個(gè)差異表達(dá)的海馬核蛋白;未暴露3xTg-AD小鼠與銅暴露3xTg-AD小鼠相比,共發(fā)現(xiàn)43個(gè)差異表達(dá)的海馬核蛋白。生物信息學(xué)分析表明,這些差異蛋白主要涉及能量代謝(NDUV1,COX5B,IDH3A,PGAM1,GPDM,KPYM)、突觸(complexin-2,synapsin-2,dynamin-1)、DNA損傷和凋亡(PDIA3,PSPC1,PURA)和氧化應(yīng)激(SODC,PRDX1,PRDX3,PRDX6)等生物過程。進(jìn)一步的Western blot和免疫組化驗(yàn)證結(jié)果表明,與未暴露WT小鼠相比,銅暴露WT小鼠糖酵解相關(guān)蛋白PGAM1、三羧酸循環(huán)相關(guān)蛋白IDH3A、突觸相關(guān)蛋白synapsin-2、氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白SODC及DNA損傷相關(guān)蛋白PDIA3的表達(dá)均與2D-DIGE結(jié)果一致;與未暴露3xTg-AD小鼠相比,銅暴露3xTg-AD小鼠突觸相關(guān)蛋白synapsin-2和DNA損傷和凋亡相關(guān)蛋白PURA、PSPC1的表達(dá)與2D-DIGE結(jié)果一致。結(jié)論:低劑量銅暴露降低AD小鼠腦ATP水平,加劇了3xTg-AD小鼠的DNA損傷及海馬神經(jīng)元凋亡,導(dǎo)致小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量顯著減少,并通過改變海馬組織核蛋白質(zhì)組,從而影響到AD相關(guān)的生理病理過程。數(shù)據(jù)結(jié)果提示,STMN1(stathmin 1)和SODC(superoxide dismutase[Cu-Zn])的變化可作為早期銅神經(jīng)毒性的潛在生物標(biāo)志物,銅暴露可能促進(jìn)了AD的演變過程。
【圖文】：

圖 1.1 細(xì)胞內(nèi)銅的運(yùn)輸機(jī)制Fig. 1.1 Mechanism of cellular copper transport1.1.2 銅與 AD已知銅與鋅、鐵一起在調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能中起關(guān)鍵作用，銅穩(wěn)態(tài)的變化對(duì)于幾種神經(jīng)退行性疾病是至關(guān)重要的[12]。銅的神經(jīng)毒性首先在威爾遜氏�。╓ilson’sdisease，WD）中被確認(rèn)，患者 ATP7B 功能受損導(dǎo)致肝、腦和其他組織中銅的過度積累[13-15]。阿爾茨海默病（AD）是最常見的神經(jīng)退行性疾病，老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)是其兩個(gè)特征性病理學(xué)標(biāo)志[16]。有文獻(xiàn)報(bào)道，具有催化活性的 Cu（II）通過氧化應(yīng)激反應(yīng)中的葡萄糖代謝失調(diào)誘導(dǎo)組織損傷來(lái)預(yù)測(cè)和觸發(fā) AD[17-19]。此外，，與 AD 相關(guān)的一些重要的標(biāo)志性分子可以與銅結(jié)合，如 Aβ，APP，β-分泌酶和 tau 蛋白[20, 21]。研究表明，銅可累積在 AD 患者的海馬、基底核、小腦和腦的突觸部位，銅過載損害突觸可塑性和加速神經(jīng)退行性過程[22]。流行病學(xué)研究也表

暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文染料高度匹配的熒光成像儀獲取三通道信號(hào)，以消除凝膠之間差異，從而檢測(cè)樣品間的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異。這里需要樣品準(zhǔn)備，熒光染料 Cy2、Cy3 和 Cy5 標(biāo)記蛋白。其中 Cy2 作為內(nèi)標(biāo)，Cy3 和 Cy5 的不同熒光強(qiáng)度體現(xiàn)了蛋白表達(dá)量的變化；熒光掃描，軟件分析差異蛋白表達(dá)，結(jié)合 MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜鑒定對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。與傳統(tǒng)雙向電泳相比 2D-DIGE 具備以下優(yōu)勢(shì)：靈敏度高、線性范圍更廣、定量精確。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2675219