發(fā)布時(shí)間：2020-05-20 00:58

【摘要】：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)、純化及鑒定 [目的]探討SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells MSCs)體外分離、純化、傳代、鑒定、標(biāo)記的方法,觀察MSCs的生物學(xué)特性,為進(jìn)一步使用MSCs移植治療大鼠血管性癡呆(Vascular dementia,VD)模型奠定基礎(chǔ)。 [方法]頸椎脫臼處死SD大鼠,收集其股骨的骨髓,采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)分離純化MSCs。通過(guò)觀察MSCs原代及傳代后細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)情況、繪制MSCs的生長(zhǎng)曲線,了解MSCs的生長(zhǎng)特性、形態(tài)特征以及增殖能力。通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定MSCs表面標(biāo)記和體外誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化對(duì)MSCs進(jìn)行鑒定。 [結(jié)果]分離培養(yǎng)的MSCs在顯微鏡下形態(tài)呈長(zhǎng)梭形,為貼壁生長(zhǎng)的成纖維樣細(xì)胞,第一次傳代后的MSCs細(xì)胞形態(tài)趨于均一,呈漩渦樣或者菊花樣生長(zhǎng)。傳代后MSCs在前1-6天生長(zhǎng)迅速,7-8天后因?yàn)榧?xì)胞密度的增加而出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象從而生長(zhǎng)速度減慢。MSCs的增殖能力隨著傳代次數(shù)的增加逐漸下降。流式細(xì)胞儀測(cè)定發(fā)現(xiàn)大鼠骨髓第三代MSCs幾乎均一表達(dá)CD 44、CD90,不表達(dá)CD34。經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)MSCs能分化為成骨細(xì)胞,茜素紅S染色可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)陽(yáng)性,堿性磷酸酶染色(alkaline phosphatase, ALP)示堿性磷酸酶活性升高。 [結(jié)論]全骨髓培養(yǎng)結(jié)合細(xì)胞貼壁法體外分離、培養(yǎng)及傳代的SD大鼠MSCs純度高,活力強(qiáng),性狀穩(wěn)定。 血管性癡呆大鼠模型的制備 [目的]探討制備理想的VD動(dòng)物模型方法,為下一步MSCs移植制作VD動(dòng)物模型。 [方法]首先利用Morris水迷宮對(duì)SD大鼠進(jìn)行篩選,去除不在95%參考值范圍之內(nèi)SD大鼠后將篩選出來(lái)的79只大鼠隨機(jī)分成兩組：假手術(shù)組10只,模型組69只。模型組采用改良二血管結(jié)扎法(2-VO)-間隔3天分別結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法制備VD大鼠VD模型,假手術(shù)組進(jìn)行同樣的手術(shù)操作,但是不結(jié)扎雙側(cè)的頸總動(dòng)脈,籠養(yǎng)4周(w)后用Morris水迷宮試驗(yàn)測(cè)定兩組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化。 [結(jié)果]84只大鼠,經(jīng)水迷宮篩選,去除4只,死亡1只。將入選實(shí)驗(yàn)的79只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組10只,模型組69只。造模前假手術(shù)組和模型組在逃避潛伏期和平臺(tái)象限滯留時(shí)間均無(wú)差異,p值大于0.05。造模后假手術(shù)組感染死亡1只,飼養(yǎng)不當(dāng)死亡2只,余7只。模型組大鼠死亡33只,存活36只,剔除1只肢體活動(dòng)障礙,3只未達(dá)VD標(biāo)準(zhǔn),本實(shí)驗(yàn)共成功制作了32只SD大鼠VD模型。造模后模型組的逃避潛伏期比假手術(shù)組明顯延長(zhǎng),平臺(tái)象限滯留時(shí)間比假手術(shù)組明顯縮短,p值小于0.01(表2)。本實(shí)驗(yàn)制作模型SD大鼠存活率52.17%,成模率91.43%。 【結(jié)論】改良后的2-VO的VD模型具有較低的死亡率,成模率較高,易于操作,重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),是建立大鼠VD模型較理想的方法。 甘露醇對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療血管性疾呆大鼠模型的療效觀察 【目的】初步探討甘露醇對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療VD大鼠模型療效的影響。 【方法】將造模成功后VD大鼠模型隨機(jī)分成培養(yǎng)基組8只(注射1ml無(wú)血清培養(yǎng)基)、MSCs組11只(注射1×106個(gè)MSCs1ml)及甘露醇+MSCs移植治療組9只(注射1.5g/kg甘露醇后,在10-30分鐘之內(nèi)注射1×106個(gè)MSCs1ml),移植后籠養(yǎng)4周,通過(guò)Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)以上三組及假手術(shù)組大鼠行為學(xué)的變化,使用ElISA檢測(cè)各組大鼠模型大腦額葉皮質(zhì)和腦脊液內(nèi)VEGF的含量,HE染色觀察額葉皮質(zhì)病理結(jié)構(gòu)的變化。 【結(jié)果】MSCs靜脈移植4W后,行為學(xué)結(jié)果為甘露醇+MSCs組和MSCs組逃避潛伏期較培養(yǎng)基組明顯縮短,平臺(tái)象限平均滯留時(shí)間延長(zhǎng)(p0.02),甘露醇+MSCs移植組比MSCs組更明顯縮短,平臺(tái)象限平均滯留時(shí)間更長(zhǎng)(p0.03)；甘露醇+MSCs組、MSCs組額葉皮質(zhì)、腦脊液VEGF含量均值比培養(yǎng)基組高(p0.001)；在額葉皮質(zhì)中,甘露醇+MSCs組、MSCs組VEGF含量均值比培養(yǎng)基組高,甘露醇+MSCs組VEGF含量均值比MSCs組高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p都為0.000；在腦脊液中,甘露醇+MSCs組分別與MSCs組、培養(yǎng)基組比較VEGF含量都高(p=0.000),MSCs組比培養(yǎng)基組含量均值高(p=0.021)。甘露醇+MSCs組及MSCs組額葉皮質(zhì)病理片顯示其病理?yè)p傷較培養(yǎng)基組輕,神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較多,神經(jīng)元腫脹、脫失及核固縮現(xiàn)象減少,而以甘露醇+MSCs組改善更明顯。 【結(jié)論】尾靜脈注射MSCs能使VD大鼠模型的空間記憶及學(xué)習(xí)能力改善；甘露醇預(yù)處理后進(jìn)行MSCs尾靜脈注射組VD大鼠模型空間記憶及學(xué)習(xí)能力改善較單獨(dú)使用MSCs組更加明顯�？赡軝C(jī)制與甘露醇與MSCs靜脈注射聯(lián)合使用后增加了顱內(nèi)VEGF的表達(dá)及增強(qiáng)了對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R749.13

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7 劉\，

本文編號(hào)：2671757