【摘要】：目的:利用大麻素Ⅱ型受體敲除(CB2R KO)小鼠與阿爾茲海默病(AD)模型小鼠APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建APP/PS1/CB2R~(-/-)模型小鼠,基于此動(dòng)物模型研究CB2R敲除后對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷進(jìn)程的影響及可能的AD病理改變和參與學(xué)習(xí)記憶損傷的相關(guān)分子機(jī)制。方法:選取癥狀前期(4月齡)、發(fā)病早期(6月齡)、發(fā)病中晚期(10月齡)模型小鼠,利用新奇物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分別評(píng)價(jià)模型小鼠非空間及空間學(xué)習(xí)記憶能力變化。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)方法檢測(cè)模型小鼠各組皮層和海馬腦區(qū)促炎因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的mRNA表達(dá)水平的變化。利用ELISA法檢測(cè)各組小鼠皮層和海馬腦區(qū)可溶性β淀粉樣蛋白1-40(Aβ_(1-40))及可溶性β淀粉樣蛋白1-42(Aβ_(1-42))含量。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和Ingenuity IPA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)4月齡模型小鼠皮層腦區(qū)全蛋白質(zhì)組進(jìn)行代謝途徑網(wǎng)絡(luò)分析,通過(guò)差異分析,從系統(tǒng)生物學(xué)角度解釋CB2R參與調(diào)控AD疾病學(xué)習(xí)記憶損傷的分子機(jī)制。利用Western Blot方法驗(yàn)證敲除CB2R影響AD疾病學(xué)習(xí)記憶損傷的主要信號(hào)分子通路變化。結(jié)果:1.新奇物體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與APP/PS1組相比,4月齡APP/PS1/CB2R~(-/-)組小鼠新奇識(shí)別指數(shù)(RI)值下降31.7%(P0.001);APP/PS1組與Ctrl組小鼠相比無(wú)明顯差異(P0.05),與APP/PS1組相比,6月齡APP/PS1/CB2R~(-/-)組小鼠RI值下降下降24.5%(P0.05);與APP/PS1組相比,10月齡APP/PS1/CB2R~(-/-)組小鼠RI值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而APP/PS1組較Ctrl組小鼠相比明顯降低(P0.001)。提示在各月齡各組模型小鼠中,APP/PS1組鼠非空間學(xué)習(xí)記憶能力呈進(jìn)行性下降,敲除CB2R對(duì)Ctrl組小鼠無(wú)影響,但是會(huì)導(dǎo)致APP/PS1組小鼠非空間認(rèn)知功能損傷提前出現(xiàn)。2.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,4月齡各組之間潛伏期與穿臺(tái)次數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),6月齡第5天APP/PS1/CB2R~(-/-)組較APP/PS1組相比潛伏期增長(zhǎng)(P0.05),提示敲除CB2R對(duì)APP/PS1小鼠空間認(rèn)知功能影響較小。3.RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在4月齡模型小鼠中,與CB2R~(-/-)組相比,APP/PS1/CB2R~(-/-)組皮層IL-6的mRNA表達(dá)水平明顯增高(P0.05),而TNF-α與iNOS表達(dá)未見明顯變化(P0.05);海馬腦區(qū)各促炎因子均未見明顯變化(P0.05);在6月齡模型小鼠中,與APP/PS1組相比,APP/PS1/CB2R~(-/-)組皮層IL-6的mRNA表達(dá)水平顯著增高(P0.05),與APP/PS1組相比,APP/PS1/CB2R~(-/-)組皮層TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著增高(P0.05),iNOS的mRNA表達(dá)水平未見明顯變化(P0.05);與APP/PS1組相比,APP/PS1/CB2R~(-/-)組海馬區(qū)IL-6的mRNA表達(dá)水平顯著增高(P0.05),而TNF-α與iNOS的mRNA表達(dá)水平未見明顯變化(P0.05)。提示APP/PS1小鼠皮層促炎因子釋放水平隨年齡增長(zhǎng)而增高,敲除CB2R導(dǎo)致APP/PS1小鼠皮層促炎因子增高提前出現(xiàn),表明神經(jīng)源性炎癥可能參與模型小鼠早期非空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷。4.ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,4月齡APP/PS1/CB2R~(-/-)組皮層可溶Aβ_(1-42)含量較APP/PS1組增高了1.67倍(P0.05),海馬腦區(qū)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,皮層及海馬區(qū)可溶性Aβ_(1-40)含量未見明顯差異,提示敲除CB2R導(dǎo)致APP/PS1小鼠早期皮層可溶性Aβ_(1-42)含量增高。5.為了進(jìn)一步探究CB2R敲除后AD模型小鼠早期即出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制,我們采用高通量高敏感度質(zhì)譜(線性軌道離子阱質(zhì)譜,Orbitrap Q-Exactive,Thermo Scientific)的蛋白質(zhì)組技術(shù)并應(yīng)用Ingenuity IPA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)全蛋白質(zhì)組進(jìn)行代謝途徑網(wǎng)絡(luò)分析,深入探尋CB2R敲除后導(dǎo)致癥狀前期(4月齡)APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙提前出現(xiàn)的的分子機(jī)制和調(diào)控模式。采用線性軌道離子阱色譜-質(zhì)譜技術(shù)對(duì)4月齡各組小鼠皮層組織進(jìn)行差異蛋白質(zhì)分析,共分析1737種蛋白,Ctrl組與APP/PS1組間有26種差異蛋白,高表達(dá)12種,低表達(dá)14種,其中成功檢測(cè)到APP蛋白的差異,表明蛋白質(zhì)組學(xué)分析可靠。敲除CB2R后,CB2R~(-/-)組與Ctrl組間有54種差異蛋白,其中高表達(dá)40種,低表達(dá)14種。APP/PS1/CB2~(-/-)組與APP/PS1組間有114種差異蛋白,其中高表達(dá)85種,低表達(dá)29種。差異蛋白的生物信息學(xué)分析顯示,APP/PS1組敲除CB2R受體后差異蛋白多參與到mTOR信號(hào)通路、p38 MAPK信號(hào)通路、GABA信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、RAN信號(hào)通路等多個(gè)信號(hào)通路改變,這些信號(hào)通路多與炎癥調(diào)節(jié)、突觸結(jié)構(gòu)重塑、線粒體功能障礙、NMDA受體調(diào)節(jié)等功能相關(guān)。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),Syngr3、Hint1、Dnm1、Ipo5等核心蛋白可能作為AD發(fā)病機(jī)制的重要影響因素。6.Western Blot結(jié)果顯示,記憶損傷出現(xiàn)前期(4月齡)敲除CB2R使模型小鼠PI-3K/AKT/mTOR信號(hào)通路及Erk1/2信號(hào)通路激活,而p38MAPK信號(hào)通路不受CB2R敲除影響。提示模型小鼠早期認(rèn)知功能障礙與相關(guān)病理改變與PI-3K/AKT/mTOR信號(hào)通路及Erk1/2信號(hào)通路異常相關(guān)。結(jié)論:敲除CB2R引起AD模型小鼠癥狀前期(4月齡)與發(fā)病早期(6月齡)出現(xiàn)腦區(qū)相關(guān)的非空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷。發(fā)病早期(6月齡)的AD模型小鼠認(rèn)知功能障礙與腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥密切相關(guān)。CB2R敲除可以導(dǎo)致癥狀前期(4月齡)AD轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能障礙提前出現(xiàn),與皮層腦區(qū)神經(jīng)毒性的Aβ_(1-42)寡聚肽過(guò)度表達(dá),皮層腦區(qū)介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及PI-3K/AKT/mTOR信號(hào)通路和Erk1/2信號(hào)通路異常激活密切相關(guān)。此外,對(duì)于癥狀前期(4月齡)模型小鼠皮層腦區(qū)差異蛋白分析提示,突觸蛋白表達(dá)和功能異�？赡苁菂⑴cCB2R敲除導(dǎo)致AD模型小鼠認(rèn)知功能障礙提前發(fā)生的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。
【圖文】：

敲除CB2R后對(duì)各月齡Ctrl與APP/PS1小鼠的新奇識(shí)別指數(shù)的影響

敲除CB2R后對(duì)各月齡Ctrl與APP/PS1小鼠水迷宮的影響
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 畢丹蕾;文朗;熊偉;申勇;;阿爾茨海默病的可能藥物靶點(diǎn)和臨床治療研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2015年04期

2 王勇為;;LTQ-Orbitrap Velos雙分壓線性阱和靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜性能及應(yīng)用[J];現(xiàn)代儀器;2010年05期

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本文編號(hào)：2671528