【摘要】： 前言 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以進(jìn)行性癡呆為臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。隨著人口的逐漸老齡化,AD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān),由于缺乏有效的治療手段,AD已成為危害人類健康的主要致死性疾病之一。AD典型病理特征包括:β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)在腦內(nèi)神經(jīng)元外病理性沉積形成的老年斑(senile plaques,SP)、神經(jīng)元內(nèi)微絲微管高度螺旋化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)和神經(jīng)元的大量丟失。到目前為止,AD的具體發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚,但越來越多的證據(jù)表明,神經(jīng)元凋亡是導(dǎo)致神經(jīng)元丟失的重要原因,神經(jīng)元的大量丟失致使AD患者認(rèn)知功能的進(jìn)行性下降�，F(xiàn)在普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡是一系列高度調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)事件的結(jié)果,其中caspase-3被證實(shí)處于該級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游,它通過降解細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)底物使細(xì)胞死亡,是凋亡事件的真正執(zhí)行者。海馬結(jié)構(gòu)與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān),且是AD最早和最易受損的部位,因此,海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元的凋亡直接影響到AD患者的認(rèn)知功能。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為:Aβ在腦組織中的沉積是各種原因誘發(fā)AD的共同通路,也是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明:Aβ的異常沉積可以啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)多種蛋白參與的系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)神經(jīng)毒性,損傷神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙等。但究竟有哪些蛋白和酶參與了Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)毒性損傷,以及這些蛋白分子之間的相互作用和調(diào)控機(jī)制如何?目前尚未完全闡明。因此,進(jìn)一步探討Aβ致神經(jīng)元損傷作用具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。 PI3-K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的促細(xì)胞存活途徑,PI3-K在生長(zhǎng)因子受體等胞外信號(hào)活化后,通過磷酸化下游蛋白激酶Akt而使其活化,活化的Akt可以磷酸化凋亡相關(guān)基因,使促凋亡基因失活、抗凋亡基因活化,從而起到抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞存活的作用。那么,Aβ致神經(jīng)元損傷作用是否與抑制了Akt的活化有關(guān)呢?關(guān)于這方面的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道尚少。 多奈哌齊(Donepezil,DN)作為一種選擇性的膽堿酯酶抑制劑而用于臨床AD的治療,能明顯提高AD患者的學(xué)習(xí)記憶能力。目前體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)DN可減少自由基的產(chǎn)生、抑制谷氨酸的興奮性毒性,但其是否可減少Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡,抑制凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá),以及此作用是否與Akt的活化有關(guān)等研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道還很少。 因此,本研究擬采用體內(nèi)外研究相結(jié)合的方法,分別進(jìn)行體外Aβ干預(yù)大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(Phaeochromocytoma cell,PC12細(xì)胞),體內(nèi)大鼠側(cè)腦室注射Aβ,同時(shí)給予多奈哌齊進(jìn)行治療,探討Aβ對(duì)神經(jīng)元的損傷作用及多奈哌齊對(duì)海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元的保護(hù)作用以及它們作用的可能機(jī)制。從而進(jìn)一步研究Aβ的神經(jīng)毒性,同時(shí)為DN的臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為預(yù)防或治療AD及其藥物開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。 材料與方法 一、體外研究 1、細(xì)胞培養(yǎng):PC12細(xì)胞在含10%胎牛血清、5%馬血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,37℃,5%CO_2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。 2、MTT比色法:選用不同濃度Aβ_(25-35)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞,24h后檢測(cè)各濃度細(xì)胞的存活率,并選擇Aβ_(25-35)的最適濃度建立神經(jīng)元損傷模型。將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組,即:未經(jīng)處理的PC12細(xì)胞作為對(duì)照組,最適濃度Aβ_(25-35)干預(yù)組為模型組。 3、流式細(xì)胞術(shù):分別檢測(cè)上述兩組PC12細(xì)胞的凋亡率。 4、細(xì)胞免疫組化法:分別檢測(cè)上述兩組PC12細(xì)胞caspase-3的表達(dá)。 二、體內(nèi)研究 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:選用中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的雄性Wistar大鼠36只,3月齡,體重250～300g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后,將大鼠隨機(jī)分為3組,即對(duì)照組、模型組及治療組,每組各12只。模型組、治療組大鼠側(cè)腦室注射Aβ_(25-35)10μl(1μg/μl),對(duì)照組大鼠采用相同方法注射等量0.9%生理鹽水。治療組于側(cè)腦室注射后第3d開始腹腔注射多奈哌齊1.5mg·kg~(-1)·d~(-1),正常對(duì)照組、模型組給予等量生理鹽水,持續(xù)4w。 2、Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試:測(cè)試各組大鼠的近期學(xué)習(xí)記憶能力,記錄其每個(gè)時(shí)間段的平均逃避潛伏期。 3、免疫組織化學(xué)染色法:觀察各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞的分布和表達(dá)情況。 4、Western blot方法:分析各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)T-Akt、P-Akt的表達(dá)水平。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)合圖像采集分析系統(tǒng),體內(nèi)外研究的全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,用單因素方差分析方法進(jìn)行組間比較,p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p＜0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、MTT比色法:檢測(cè)到PC12細(xì)胞活性呈Aβ_(25-35)濃度依賴性下降,Aβ_(25-35)的最適作用濃度是20μM。 2、流式細(xì)胞術(shù):檢測(cè)到模型組PC12的凋亡率較對(duì)照組明顯增加。 3、免疫組化染色:模型組caspase-3的表達(dá)較對(duì)照組明顯增多(p＜0.01)。 二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、Morris水迷宮測(cè)試:模型組大鼠各時(shí)間段的平均潛伏期較對(duì)照組延長(zhǎng)(p＜0.01),而治療組各時(shí)間段的平均潛伏期較模型組縮短(p＜0.05)。 2、免疫組織化學(xué)方法:caspase-3陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒狀,主要沉積在海馬結(jié)構(gòu)CA1、CA3區(qū)的錐體細(xì)胞層及齒狀回(DG)的顆粒細(xì)胞層。對(duì)照組大鼠海馬結(jié)構(gòu)3個(gè)亞區(qū)可見少量的caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元;模型組陽(yáng)性神經(jīng)元較多,陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物著色較對(duì)照組加深,平均光密度值均較對(duì)照組明顯增高(p＜0.01);而治療組caspase-3陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度值均較模型組減少(p＜0.05)。 3、Western blot方法:三組大鼠海馬結(jié)構(gòu)的T-Akt的表達(dá)量無顯著差異(p＞0.05),模型組P-Akt的表達(dá)較對(duì)照組降低(p＜0.05),治療組P-Akt的表達(dá)量相對(duì)于模型組呈升高趨勢(shì)(p＜0.05)。 結(jié)論 1、Aβ_(25-35)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡與其促凋亡基因caspase-3的高表達(dá)有關(guān)。 2、Aβ_(25-35)促caspase-3的表達(dá)可能與其抑制了Akt的磷酸化水平有關(guān)。 3、多奈哌齊減少大鼠海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元caspase-3的表達(dá)可能與其上調(diào)Akt的磷酸化水平有關(guān)。
【圖文】：

MTT法檢測(cè)不同濃度A民5一35處理24h后PclZ細(xì)胞的活性(‘乍<0.05)二、PC12細(xì)胞的凋亡率流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖2)20卜MA民5一35干預(yù)PclZ細(xì)胞24h后，DNA直方圖上可見GO/GI峰前出現(xiàn)1個(gè)明顯的亞2倍體峰(即凋亡峰)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(表1)顯示模型組凋亡率為23.03士1.22%，而對(duì)照組凋亡率為2.42士0.87%勿<0.01)。t沖七ns勺勻二電g減.‘氣杖時(shí)伽5咚偽，，6、〕 p62娜g口口兇皿只幽C卜一nne奮，(rLZH)C卜.n六七卜(「吐H〕a:對(duì)照組b:模型組圖2，流式細(xì)胞儀檢測(cè)A民5一35處理PC12細(xì)胞DNA含量變化三、PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下觀察到對(duì)照組PclZ細(xì)胞(照片la)多呈圓形或橢圓形，胞體飽滿，折光度好
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2663686