【摘要】：晝夜節(jié)律系統(tǒng)正常功能的維持在各個生命領域都是不可或缺的。出現(xiàn)于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)早期的晝夜節(jié)律紊亂(Circadian rhythm disorder,CRD),嚴重影響患者生活質量并可加重AD的發(fā)生發(fā)展,故尋找針對AD晝夜節(jié)律紊亂的治療手段意義重大。β淀粉樣蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)在近年來被認為與AD晝夜節(jié)律紊亂的形成關系密切。研究發(fā)現(xiàn),2型糖尿病和AD在病理表現(xiàn)和發(fā)病機制中存在諸多相似性,這可能為AD的治療提供了新的探索方向。胃泌酸調節(jié)素(Oxyntomodulin,OXM)作為體內天然的胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)/胰高血糖素雙受體激動劑,是一種新型糖尿病治療藥物,目前OXM類似物D-Ser2-Oxyntomodulin(Oxy)的神經保護作用已經逐漸被證實且其在腦中發(fā)揮效應主要依賴于GLP-1受體的活化。但Oxy對AD晝夜節(jié)律紊亂是否也有改善作用尚不明確。本研究在動物水平通過小鼠自主跑輪行為學實驗和實時熒光定量PCR(Real-time PCR)實驗首次證實Oxy對Aβ31-35所致小鼠晝夜節(jié)律紊亂和海馬生物鐘基因Bmal1和Per2異常表達具有改善作用,在離體水平證實Oxy以劑量依賴的方式拮抗Aβ31-35對小鼠海馬HT22神經細胞系的毒性作用,同時使用Real-time PCR和Western Blot實驗明確Oxy可顯著改善Aβ31-35所致HT22細胞內生物鐘基因Bmal1和Per2異常表達。使用慢病毒干擾GLP-1受體基因后發(fā)現(xiàn),GLP-1受體基因沉默可誘導生物鐘基因Bmal1和Per2異常表達,且此時Oxy無法繼續(xù)發(fā)揮神經保護作用。以上結果表明Oxy可顯著改善Aβ31-35所致晝夜節(jié)律紊亂和生物鐘基因異常表達,且GLP-1受體在Oxy發(fā)揮改善效應過程中起著重要作用,這為AD患者晝夜節(jié)律紊亂的防治提供了新的思路和實驗支持。第一部分Aβ31-35誘導晝夜節(jié)律紊亂及生物鐘基因表達異常目的:驗證Aβ31-35可誘導小鼠晝夜節(jié)律紊亂的發(fā)生、小鼠海馬內生物鐘基因的異常表達及小鼠海馬HT22細胞生物鐘基因的異常表達。方法:將6-8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為2組:Control組、Aβ31-35組。應用跑輪行為學實驗觀察小鼠的晝夜跑輪節(jié)律活動,檢測小鼠運動活性、自由運轉周期和晝/夜活動量變化。使用Real-time PCR檢測小鼠海馬內生物鐘基因Bmal1和Per2的節(jié)律性變化。選取小鼠海馬HT22神經細胞系并分為Control組和Aβ31-35組,用CCK-8細胞毒性實驗檢測Aβ31-35為2.5,5和10μM時細胞存活率,Real-time PCR和Western Blot檢測Aβ31-35劑量為5μM時HT22細胞生物鐘基因在不同時間點表達水平改變。結果:(1)與Control組相比,Aβ31-35組小鼠的跑輪活動較為散亂,每日睡眠-運動模式無規(guī)律,運動活性降低、自由運轉周期延長及小鼠主觀白天活動量增加。(2)與Control組相比,Aβ31-35組小鼠海馬生物鐘基因Bmal1和Per2 mRNA表達出現(xiàn)相位延遲,分別在CT20和CT16時間點表達水平明顯降低。(3)2.5,5和10μM Aβ31-35可致HT22細胞存活率顯著降低,與Control組相比均有統(tǒng)計學差異。(4)與Control組相比,Aβ31-35組HT22細胞內Bmal1和Per2出現(xiàn)異常表達,分別在CT20和CT16時間點出現(xiàn)mRNA和蛋白表達水平的明顯降低。結論:Aβ31-35可以誘導小鼠晝夜節(jié)律紊亂及生物鐘基因Bmal1和Per2表達異常。第二部分D-Ser2-Oxyntomodulin(Oxy)改善Aβ31-35所致晝夜節(jié)律紊亂及生物鐘基因表達異常目的:驗證D-Ser2-Oxyntomodulin(Oxy)對Aβ31-35所致小鼠晝夜節(jié)律紊亂、小鼠海馬內生物鐘基因的異常表達及小鼠海馬HT22細胞生物鐘基因的異常表達的改善作用。方法:將6-8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為4組:Control組、Aβ31-35組、Oxy預處理組(Oxy+Aβ31-35組)及Oxy單獨給藥組(Oxy組),應用跑輪行為學實驗觀察各組小鼠的晝夜跑輪運動節(jié)律,檢測小鼠運動活性、自由運轉周期和晝/夜活動量變化。使用Real-time PCR檢測小鼠海馬內Bmal1和Per2的節(jié)律性變化。選取小鼠海馬HT22神經細胞系也分為以上四組,CCK-8法檢測Oxy對細胞存活率影響,Real-time PCR和Western Blot檢測Oxy對Bmal1和Per2異常表達的作用。結果:(1)與Aβ31-35組小鼠相比,Oxy預處理組小鼠跑輪活動較為規(guī)律,每日睡眠-運動的模式較為固定,運動活性升高,自由運轉周期縮短,主管白天活動量相對減少。(2)與Aβ31-35組相比,Oxy預處理組小鼠海馬內生物鐘基因Bmal1和Per2 mRNA表達相位的延遲有所恢復,表達水平分別在CT20和CT16顯著提高。(3)1,10,100,200 nM Oxy預處理均可改善Aβ31-35所致HT22細胞存活率的降低,其中100和200 nM劑量可致細胞存活率顯著提高,與5μM Aβ31-35組相比有統(tǒng)計學差異。(4)與Aβ31-35組相比,Oxy預處理組HT22細胞內Bmal1和Per2 mRNA和蛋白的異常表達得到改善,表現(xiàn)為表達水平分別在CT20和CT16顯著提高。結論:Oxy對Aβ31-35所致晝夜節(jié)律紊亂及生物鐘基因Bmal1和Per2表達異常具有改善作用。第三部分GLP-1受體參與Oxy改善Aβ31-35所致HT22細胞生物鐘基因異常表達目的:觀察GLP-1受體基因沉默后對HT22細胞內生物鐘基因表達的影響,觀察此時Oxy對Aβ31-35所致生物鐘基因異常表達是否仍具有改善作用。方法:首先使用含GLP-1R-shRNA-GFP的慢病毒質粒對HT22細胞進行感染,鏡下觀察感染效率,并使用Real-time PCR和Western Blot檢驗沉默效率。將GLP-1R基因沉默的HT22細胞分為四組:慢病毒組(LV-shGLP-1R組)、慢病毒+Aβ31-35組(LV-shGLP-1R+Aβ31-35組)、慢病毒+Oxy+Aβ31-35組(LV-shGLP-1R+Oxy+Aβ31-35組)和慢病毒+Oxy組(LV-shGLP-1R+Oxy組)。同時將未經感染的HT22細胞作為Control組,Real-time PCR檢測各組在CT4、CT8、CT12、CT16、CT20和CT24共6個不同時間點細胞內生物鐘基因Bmal1和Per2的節(jié)律性表達。結果:(1)與Control組相比,LV-shGLP-1R組細胞內生物鐘基因Bmal1和Per2表達水平在各個時間點均有所下降。(2)與LV-shGLP-1R+Aβ31-35組相比,LV-shGLP-1R+Oxy+Aβ31-35組細胞內Bmal1和Per2的異常節(jié)律性表達無明顯改善。結論:GLP-1受體基因沉默誘導HT22細胞生物鐘基因Bmal1和Per2的表達水平降低,且GLP-1R基因沉默后,Oxy無法改善Aβ31-35在HT22細胞內誘導的Bmal1和Per2異常表達。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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本文編號：2662081